]]>1.1適用范圍
本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細(xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導(dǎo)致反復(fù)核對，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等
1.2提取風(fēng)險提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取
2、組織送樣量要求
注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請單獨溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進(jìn)行，請酌情增加送樣量
2.1常規(guī)植物組織送樣要求
| 物種 | 舉例說明 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g） | |||||
| 葉子 | 根 | 莖 | 花 | 果實 | 種子 | ||||
| 普通禾本科植物 | 水稻 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | 2 | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 玉米、小麥等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – | |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 豆科草本植物 | 大豆、苜蓿、落花生等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 芭蕉科植物 | 香蕉、芭蕉、旅人蕉等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 松科植物 | 馬尾松、云杉、濕地松等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 瑞香科植物 | 狼毒、結(jié)香等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 薯類植物植物 | 木薯、番薯、土豆、山藥等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 其他落葉喬木 | 楊樹、梧桐、懸鈴木等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 水果類 | 葡萄、檸檬、龍眼等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 薔薇科 | 桃、蘋果、梨、草莓等 | DNA | 重測序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 物種 | 舉例說明 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g） | |||||
| 葉子 | 根 | 莖 | 花 | 果實 | 種子 | ||||
| 中藥 | 人參、三七、何首烏等 | DNA | 重測序 | 0.3 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.3 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 仙人掌科 | 火龍果、仙人掌（取外皮）等 | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 蒺藜科 | 白刺 | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 獼猴桃科 | 獼猴桃 | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.3 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 大型真菌 | 蘑菇，靈芝，木耳等 | DNA | 重測序 | 0.3 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.3 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | – | – | – | – | – | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 真核小RNA | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 殼斗科 | 板栗、櫟樹、 青岡等 | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 槭樹科 | 雞爪槭，元寶槭，糖槭等 | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 錦葵科 | 蜀葵，秋葵 | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 石斛 | 石斛（干樣、炮制） | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 藻類 | 海帶、紫菜、微藻、海藻、抑食金球藻 | DNA | 重測序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物重測序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
| 真核小RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
3、核酸送樣要求
1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型
2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關(guān)實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中
3.1二代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | SLAF | 重測序 | 甲基化 | 外顯子 | FFPE | PCR產(chǎn)物 | PCR-free | chip-seq |
| 濃度ng/ul | 5 | 1 | 5 | 6 | 14 | 0.6 | 40 | 1 |
| 總量ug | 1.5 | 0.1 | 1 | 0.1 | 0.25 | 0.1 | 1 | 0.06 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 15 | 20 | 15 | 15 | 15 |
3.2三代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | ONT動植物重測序 | ONT動植物基因組 | PB動植物基因組 | 超長 |
| 濃度ng/ul | 40 | 100 | 50 | 50 |
| 總量ug | 4 | 10 | 15 | 15 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 50 |
3.3RNA類送樣量要求
1)針對核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量
2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實驗的開展
3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品
4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈
5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險，為保證樣本一次檢測合格并節(jié)約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請在核酸量足夠的前提下盡量按照送樣建議來送樣
| 項目類型 | 初檢結(jié)果（濃度、體積、純度） | 樣品狀態(tài) | ||
| 濃度（ng/ul） | 總量（ug） | 體積(ul) | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 20 | 1 | 15 | 正常 |
| 真核小RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
| 長鏈非編碼RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
4、樣品制備保存指南
4.1常規(guī)植物類樣本（不含藻類）制備流程
由于老葉或其它組織DNA&RNA含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對較高，因此，為降低DNA&RNA提取難度并減少污染物干擾，請盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外藻類組織中的水分會影響提取得率，取樣時需將組織樣中的水分吸干。建議在采集樣本之前，將樣本置于黑暗環(huán)境24-48小時后再制備樣本（停止光合作用，減少代謝干擾），新鮮組織樣采樣流程如下：
1)用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織（注：如果是需要進(jìn)行處理，請在活體上進(jìn)行處理后再取樣
2)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準(zhǔn)備好的凍存管中
3)處理好的組織樣本混合均勻后立即保存于提前標(biāo)記編號、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管
4)液氮凍存前將樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，處理好的組織樣本混合均勻后保存于提前標(biāo)記編號、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管
5)迅速置于液氮中冷凍 1~2 h，然后按照順序依次放入樣品盒中（不建議自封袋送樣），轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存（禁止亂放，尤其是項目中樣品個數(shù)較多時），干冰運(yùn)輸
注：植物組織不建議使用組織保護(hù)液保存。對于一些需要剝?nèi)シN皮處理的，因樣品速凍后無法準(zhǔn)確剔除，如有需要剝?nèi)シN皮的老師須自行操作
4.2Ultra Long ONT類植物樣本
4.2.1植物組織選取及取樣步驟
1)準(zhǔn)備剪刀、鑷子、錫箔紙，選取新鮮幼嫩的組織， 例如幼嫩的葉片（也可以是新長出的幼嫩根尖）
2)除去枯萎的，損傷的部分，除去莖，葉柄和粗的葉脈
3)將組織清理干凈，可放在容器中用水沖洗，除去雜質(zhì)和其他殘余碎片
4)將清洗干凈的樣本倒在吸水紙上，再蓋上一張吸水紙用手輕輕壓幾次（注意不要太用力損傷 葉片），水盡可能除去
5)將葉片稱量一下，每0.5g/管（推薦使用 50ml 離心管）裝好，標(biāo)注樣本名稱，日期，準(zhǔn)確重量
6)放入液氮快速冷凍 10min，轉(zhuǎn)入-80 °C 冰箱保存，干冰運(yùn)輸
7)葉片剪下后的稱量等操作，請在 10min 內(nèi)完成，時間過長會導(dǎo)致葉片失水不可用，部分地區(qū)氣溫較高失水更快，操作時間需更短
4.2.2注意事項與說明
1)葉片要幼嫩的、新鮮的 、完整的（不要有損傷），可用手對比老葉和嫩葉的觸感，嫩葉的觸感非常柔軟
2)林木 、灌木類的請根據(jù)生長周期來確定采樣時間， 最好是發(fā)芽后長出來的嫩葉
3)禾本科黃化苗 1-2 周，最好有專門的黃化經(jīng)驗，黃化太過會造成細(xì)胞核難提取 。如果不會黃化就送 1-2 周剛長出來的葉片，具體生長時間需根據(jù)植物的生長狀態(tài)判斷
4)組培苗，不建議直接使用，盡量移植到土壤中培育出植株，取新長出的幼嫩葉片，若使用組培苗送樣，請客戶多準(zhǔn)備備份樣本
5)送樣前請拍照記錄樣品狀態(tài)
5、注意事項
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實驗器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照送樣手冊所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取
1)組織速凍時間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時間過短會導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險
2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動物皮膚、毛發(fā)等。請嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險
3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解
4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解
6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸
7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況
8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性
9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣
10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取
11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質(zhì)量會造成不同程度的影響，常見的會導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時，務(wù)必請在樣本信息單中進(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)
6、不合格樣品存在風(fēng)險
6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
6.2降解樣本風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差
6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常
6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染
1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量
2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題
3)文庫構(gòu)建失敗
4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
6.4目標(biāo)RNA含量低
1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗
2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高
]]>1、前言
1.1適用范圍
本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細(xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導(dǎo)致反復(fù)核對，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等
1.2提取風(fēng)險提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取
2、組織送樣量要求
注1：未在表格出現(xiàn)的物種，請單獨溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進(jìn)行，請酌情增加送樣量
注2：由于骨骼含有大量鈣鹽和礦物質(zhì)，細(xì)胞密度低，核酸含量較少；毛發(fā)暴露在外界環(huán)境，容易受到紫外線、溫度變化、微生物影響，導(dǎo)致核酸降解，毛干核酸含量低，毛囊周圍細(xì)胞多難獲取，為了保證您實驗的順利進(jìn)行，這兩個部位不建議送組織樣，建議自行提取
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g/ml/個） | |||||||||
| 心臟 | 肝臟 | 脾臟 | 腎臟 | 腦 | 肌肉 | 腸道 | EDTA抗凝血液 | PAXgene管送樣血液 | 細(xì)胞 | |||
| 人 | DNA | 重測序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 |
| 外顯子 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| ONT動植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| PB動植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 5*10e6 | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 鼠 | DNA | 重測序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 |
| 外顯子 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| ONT動植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| PB動植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 5*10e6 | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（g） |
| 皮膚 | DNA | 重測序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動植物重測序 | 1 | ||
| ONT動植物基因組 | 1 | ||
| PB動植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | ||
| 毛發(fā) | DNA | 重測序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動植物重測序 | 1 | ||
| ONT動植物基因組 | 1 | ||
| PB動植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | ||
| 骨骼 | DNA | 重測序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動植物重測序 | 1 | ||
| ONT動植物基因組 | 1 | ||
| PB動植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 |
3、核酸送樣要求
1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型
2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關(guān)實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中
3.1二代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | SLAF | 重測序 | 甲基化 | 外顯子 | FFPE | PCR產(chǎn)物 | PCR-free | chip-seq |
| 濃度ng/ul | 5 | 1 | 5 | 6 | 14 | 0.6 | 40 | 1 |
| 總量ug | 1.5 | 0.1 | 1 | 0.1 | 0.25 | 0.1 | 1 | 0.06 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 15 | 20 | 15 | 15 | 15 |
3.2三代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | ONT動植物重測序 | ONT動植物基因組 | PB動植物基因組 | 超長 |
| 濃度ng/ul | 40 | 100 | 50 | 50 |
| 總量ug | 4 | 10 | 15 | 15 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 50 |
3.3RNA類送樣量要求
1)針對核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量
2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實驗的開展
3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品
4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈
5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險，為保證樣本一次檢測合格并節(jié)約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請在核酸量足夠的前提下盡量按照送樣建議來送樣。
| 項目類型 | 初檢結(jié)果（濃度、體積、純度） | 樣品狀態(tài) | ||
| 濃度（ng/ul） | 總量（ug） | 體積(ul) | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 20 | 1 | 15 | 正常 |
| 真核小RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
| 長鏈非編碼RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
4、樣品制備保存指南
4.1常規(guī)動物類樣本
送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對較高的組織，樣本制備優(yōu)先級：血液>內(nèi)臟>肌肉。活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈
4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）
1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）
2)活體取下新鮮的組織
3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號
6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
7)干冰運(yùn)輸
4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞和研磨后的組織適用）
1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量
2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時選擇干冰寄送
3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣
4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）
1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊
2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存
3)RNAlater? Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存
4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存
5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存
注：如果組織較小，建議優(yōu)先選擇此方式送樣
4.2全血
DNA類產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時間過長。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿。
4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
注1：血液采集管請盡量不要用需專門對應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對應(yīng)試劑盒影響提取時間（盡量送樣前溝通）
注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎
4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程
4.2.2.1新鮮血液
1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期，體積）
2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置
3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實驗人員手中不可超過 3 天
4.2.2.2凍存血液
1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次
2)哺乳動物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）
3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）
4)做好標(biāo)記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送
4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程
4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動物優(yōu)先選擇該方式送樣）
1)PAXgene管的介紹
在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測試中，采集全血是第一步。 這類測試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時內(nèi)迅速降解。 此外，通過基因誘導(dǎo)過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對數(shù)量估計過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時，PAXgene 血液 RNA 管可以實現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測和定量
2)采集前準(zhǔn)備
A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）
B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）
C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）
D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）
3)采集流程
A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識別標(biāo)簽
B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管
C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管
D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次
E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲 PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時，最多 72 小時，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲溫度，請參見“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息
4)注意事項
A.確保采血管在有效期內(nèi)，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）
B.不可預(yù)先打開管蓋，避免穩(wěn)定劑失效
C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險，請按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議
D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯誤或產(chǎn)品性能欠佳
E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA
4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
4.3細(xì)胞
4.3.1貼壁細(xì)胞
4.3.1.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.3.1.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細(xì)胞溶解物的黏度來判斷。在細(xì)胞剛?cè)芙鈺r，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加裂解液。裂解液加入量過少，會導(dǎo)致抽提的 RNA 降解
4.3.2懸浮細(xì)胞
4.3.2.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.3.2.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
5、注意事項
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實驗器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照送樣手冊所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取
1)組織速凍時間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時間過短會導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險
2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動物皮膚、毛發(fā)等。請嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險
3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解
4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解
6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸
7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況
8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性
9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣
10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取
11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質(zhì)量會造成不同程度的影響，常見的會導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時，務(wù)必請在樣本信息單中進(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)
6、不合格樣品存在風(fēng)險
6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
6.2降解樣本風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差
6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常
6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染
1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量
2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題
3)文庫構(gòu)建失敗
4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
6.4目標(biāo)RNA含量低
1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗
2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高
]]>1、前言
1.1適用范圍
本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細(xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導(dǎo)致反復(fù)核對，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等
1.2聲明
對于危害程度為第一、二類的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織樣。對于危害程度為三、四類的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過銷售或運(yùn)營與醫(yī)學(xué)實驗平臺負(fù)責(zé)人溝通，確認(rèn)無高致病和傳染性且能進(jìn)行后續(xù)實驗后再安排樣品寄送。危害程度的判定標(biāo)準(zhǔn)具體參見《人間傳染的病原微生物名錄》
1.3提取風(fēng)險提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取
2、組織送樣量要求
注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請單獨溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進(jìn)行，請酌情增加送樣量
2.1常規(guī)動物類組織送樣要求
| 物種 | 舉例說明 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g） | ||||||
| 心臟 | 肝臟 | 脾臟 | 腎臟 | 腦 | 肌肉 | 腸道 | ||||
| 常規(guī)動物 | 哺乳動物、禽類、爬行動物 | DNA | 重測序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 |
| SLAF | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.5 | 0.5 | |||
| PB動植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 1 | 1 | |||
| Ultra Long ONT | – | 1 | 1 | 1 | – | 1 | 1 | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |||
| 節(jié)肢動物 | 昆蟲（蚊子、蒼蠅、螞蟻） | DNA | 重測序 | – | – | – | – | – | 0.2 | – |
| SLAF | – | – | – | – | – | 0.2 | – | |||
| 甲基化 | – | – | – | – | – | 0.2 | – | |||
| ONT動植物重測序 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| ONT動植物基因組 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| PB動植物基因組 | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 真核小RNA | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 長鏈非編碼RNA | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 水產(chǎn)動物 | 蝦、蟹、魚等（針對微小組織類型 需要在干冰上進(jìn)行，注意操作時間不宜過長） | DNA | 重測序 | – | – | – | – | – | 0.3 | – |
| 外顯子 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| 甲基化 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| ONT動植物重測序 | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| ONT動植物基因組 | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| PB動植物基因組 | – | – | – | – | – | 1.5 | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | 1.5 | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 真核小RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（g） |
| 皮膚 | DNA | 重測序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動植物重測序 | 1 | ||
| ONT動植物基因組 | 1 | ||
| PB動植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 |
2.2動物類血液送樣量
| 組織部位 | 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（ml） |
| 全血 | 哺乳動物 | DNA-EDTA抗凝 | 重測序 | 0.3 |
| SLAF | 0.3 | |||
| 甲基化 | 0.3 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.5 | |||
| ONT動植物基因組 | 0.5 | |||
| PB動植物基因組 | 1 | |||
| Ultra Long ONT | 1 | |||
| RNA-PAXgen管送樣 | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 10 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 10 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 10 | |||
| 真核小RNA | 10 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 10 | |||
| RNA-EDTA抗凝 | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 | |||
| 禽類 | DNA-EDTA抗凝 | 重測序 | 0.05 | |
| SLAF | 0.05 | |||
| 甲基化 | 0.05 | |||
| ONT動植物重測序 | 0.1 | |||
| ONT動植物基因組 | 0.1 | |||
| PB動植物基因組 | 0.1 | |||
| Ultra Long ONT | 0.1 | |||
| RNA-EDTA抗凝 | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 |
2.3動物類細(xì)胞送樣量
| 組織部位 | 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（個） |
| 細(xì)胞 | DNA | 重測序 | 1*10e6 | |
| SLAF | 1*10e6 | |||
| 甲基化 | 1*10e6 | |||
| ONT動植物重測序 | 5*10e6 | |||
| ONT動植物基因組 | 5*10e6 | |||
| PB動植物基因組 | 5*10e6 | |||
| Ultra Long ONT | 1*10e7 | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 5*10e6 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 5*10e6 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 3*10e6 | |||
| 真核小RNA | 3*10e6 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 3*10e6 | |||
3、核酸送樣要求
1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型
2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關(guān)實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中
3.1二代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | SLAF | 重測序 | 甲基化 | 外顯子 | FFPE | PCR產(chǎn)物 | PCR-free | chip-seq |
| 濃度ng/ul | 5 | 1 | 5 | 6 | 14 | 0.6 | 40 | 1 |
| 總量ug | 1.5 | 0.1 | 1 | 0.1 | 0.25 | 0.1 | 1 | 0.06 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 15 | 20 | 15 | 15 | 15 |
3.2三代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | ONT動植物重測序 | ONT動植物基因組 | PB動植物基因組 | 超長 |
| 濃度ng/ul | 40 | 100 | 50 | 50 |
| 總量ug | 4 | 10 | 15 | 15 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 50 |
3.3RNA類送樣量要求
1)針對核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量
2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實驗的開展
3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品
4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈
5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險，為保證樣本一次檢測合格并節(jié)約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請在核酸量足夠的前提下盡量按
| 項目類型 | 初檢結(jié)果（濃度、體積、純度） | 樣品狀態(tài) | ||
| 濃度（ng/ul） | 總量（ug） | 體積(ul) | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 20 | 1 | 15 | 正常 |
| 真核小RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
| 長鏈非編碼RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
4、樣品制備保存指南
4.1常規(guī)動物類樣本（脊柱動物、哺乳動物）
常規(guī)動物主要包括脊椎動物組織樣本主要包括：哺乳動物、禽類、爬行動物以及兩棲動物。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對較高的組織，樣本制備優(yōu)先級：血液>內(nèi)臟>肌肉?；铙w取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈
4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）
1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）
2)活體取下新鮮的組織
3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號
6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
7)干冰運(yùn)輸
4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞組織適用）
1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量
2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時選擇干冰寄送
3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣
4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）
1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊
2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存
3)RNAlater? Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存
4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存
5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存
4.2全血
DNA類產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時間過長。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿
4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
注1：血液采集管請盡量不要用需專門對應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對應(yīng)試劑盒影響提取時間（盡量送樣前溝通）
注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎
4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程
4.2.2.1新鮮血液
1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期，體積）
2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置
3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實驗人員手中不可超過 3 天
4.2.2.2凍存血液
1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次
2)哺乳動物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）
3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）
4)做好標(biāo)記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送
4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程
4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動物優(yōu)先選擇該方式送樣）
1)PAXgene管的介紹
在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測試中，采集全血是第一步。 這類測試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時內(nèi)迅速降解。 此外，通過基因誘導(dǎo)過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對數(shù)量估計過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時，PAXgene 血液 RNA 管可以實現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測和定量
2)采集前準(zhǔn)備
A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）
B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）
C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）
D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）
3)采集流程
A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識別標(biāo)簽
B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管
C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管
D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次
E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲 PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時，最多 72 小時，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲溫度，請參見“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息
4)注意事項
A.確保采血管在有效期內(nèi)，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）
B.不可預(yù)先打開管蓋，避免穩(wěn)定劑失效
C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險，請按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議
D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯誤或產(chǎn)品性能欠佳
E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA
4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
4.3昆蟲
1)昆蟲樣本，需進(jìn)行表面微生物的清洗，某些吸血性昆蟲，例如蚊子，血吸蟲，該類型樣本可能存在外源污染，需要進(jìn)行切腹，去除腸道處理。較大個體的選取不帶腸道部分的組織，將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。?，對于較小個體只能用整個個體的，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（注意保證昆蟲的活性）
2)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）
3)轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
注1：小型昆蟲組織務(wù)必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時該類樣本因只滿足一次或低于常規(guī)一次提取用量，我們無法保證100%提取合格
注2：蜜蜂送樣時盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常，影響后續(xù)實驗。不建議送實驗室剔除，因為組織速凍過之后再剔除會化凍，提取降解的可能性較大
4.4微生物
4.4.1細(xì)菌
1)顯微鏡下觀察細(xì)菌生長狀態(tài)，建議收集生長期處于對數(shù)期的細(xì)菌
2)將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min
3)棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸
5)以下為不規(guī)范送樣圖片：菌體平板（左圖），菌液送樣（右圖）
4.4.2真菌
4.4.2.1單細(xì)胞真菌
單細(xì)胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×107個，以 5×106-1× 107個為宜。您要做的項目要求送樣量較大時，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨保存
1)顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，最好收集生長期處于對數(shù)期的酵母菌
2)將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min
3)棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸
4.4.2.2多細(xì)胞真菌（大型真菌）
1)取完整菌體，先用大量清水沖洗其表面雜質(zhì)，再用純水清洗一遍，使用吸水紙吸干表面的水份后，用剪刀將組織分割為小塊，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期,，體 積）放液氮里速凍，干冰寄送
2)菌絲：將無菌棉簽輕輕觸碰菌落或菌斑的中心部分，避免碰到邊緣或其他細(xì)菌來源。然后，將棉簽迅速劃過培養(yǎng)基表面，以收集菌絲轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。(可根據(jù)樣品量收集多管或使用15mL螺旋管收集）
4.5水產(chǎn)類
水產(chǎn)類包括淡水魚類、海水魚類、貝類、藻類。送樣需要選擇新鮮采集的樣本
1)優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時應(yīng)選取核酸含量較多的部位
2)取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體
3)活體取材后用預(yù)冷的0.9%生理鹽水進(jìn)行清洗，去除血漬和污物
4)將樣品分割成50 mg左右的小塊（約黃豆大?。瑯悠贩指詈吞幚頃r應(yīng)盡量在冰上進(jìn)行，防止樣品降解。避免裝樣太滿以至凍裂，造成樣品污染
注：水產(chǎn)類樣品需盡量保證為新鮮個體。盡量避免寄送保存時間較長或經(jīng)過反復(fù)凍融的組織樣品。針對軟體動物可先使用75%的乙醇進(jìn)行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運(yùn)輸；針對刺胞動物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取
4.6細(xì)胞
4.6.1貼壁細(xì)胞
4.6.1.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.6.1.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.6.2懸浮細(xì)胞
4.6.2.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.6.2.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送
5、注意事項
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實驗器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照送樣手冊所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。
1)組織速凍時間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時間過短會導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險
2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動物皮膚、毛發(fā)等。請嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險
3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解
4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解
6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸
7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況
8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性
9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣
10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取
11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質(zhì)量會造成不同程度的影響，常見的會導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時，務(wù)必請在樣本信息單中進(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)
6、不合格樣品存在風(fēng)險
6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
6.2降解樣本風(fēng)險
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差
6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常
6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染
1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量
2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題
3)文庫構(gòu)建失敗
4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測序或測序數(shù)據(jù)量不足
6.4目標(biāo)RNA含量低
1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗
2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高
]]>一、百邁客Hi-C取樣要求
1、基本要求
1.1安全
1)人身安全：現(xiàn)有實驗條件下（采取一定防護(hù)后），樣品對實驗人員本身無傷害
2)環(huán)境安全：樣品對室內(nèi)、室外環(huán)境無影響（以免因為不小心導(dǎo)致一些活體樣本進(jìn)入外界 環(huán)境造成不良影響）
1.2無污染
1)植物樣本不得有其它植物的污染，不得有病害，不得有蟲害（尤其是一些肉眼不容易發(fā) 現(xiàn)的蟲卵等）
2)全血樣品不得引入取血物種本身攜帶的病菌、病毒等潛在污染
1.3依據(jù)“理論”&“實踐”
1)“理論”：基于各種實驗原理的理論依據(jù)
2)“實踐”：基于 BMK 本身積累的多物種、多樣品的項目經(jīng)驗
1.4送樣說明
1)客戶或銷售人員應(yīng)將樣本的信息詳細(xì)說明，所有樣品必須標(biāo)注好關(guān)鍵樣品信息：如物種名 稱、樣品名稱、到樣日期、是否需要返樣等
2)樣品信息單必須早于或與樣品同時到達(dá)公司，一則方便樣品中心錄樣，二則方便項目盡快 啟動
3)因為樣品首次取樣不足、質(zhì)量不好或信息單未及時到位造成項目進(jìn)度延后時需要由客戶或 銷售部承擔(dān)相關(guān)責(zé)任（特殊項目除外）
4)因公司內(nèi)部培養(yǎng)條件不能同時滿足各種物種的生長需求，因此，送達(dá)活體樣品應(yīng)該盡量是 送到即可進(jìn)行實驗的樣品（量足，質(zhì)好），不建議在公司保存過長時間，防止培養(yǎng)樣本死亡
5)所有需要特殊關(guān)注的樣品，在華開任務(wù)單中需要備注相關(guān)信息，并提前郵件通知 Hi-C 相關(guān) 注意事項；特殊物種需要書面告知材料培養(yǎng)條件（光、溫度、水、肥 or 有機(jī)營養(yǎng)物等等）
6)生長狀態(tài)趨于不好的樣品，或一些離體枝條需要提前與實驗溝通，保證到樣后可及時處理 樣品
1.5法定節(jié)假日期間和周末送樣要求
1)節(jié)假日當(dāng)天及假日前后各一周不建議再到樣， 如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實驗平臺溝通送樣需求
2)周末休息日2 天不建議到樣，如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實驗平臺溝通送樣需求
2、動物樣本-全血
2.1新鮮血液
血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后立即送樣，并盡量確 保 24h 內(nèi)運(yùn)至實驗室
2.2凍存血液
血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后直接液氮速凍，干冰 運(yùn)輸
2.3血液需求量
每一個樣品，建議送樣 1~2 mL
2.4全血取樣注意事項（防止污染、溶血）
1)取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液 樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染
2)準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）
3)依據(jù)抗凝管的實際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL 規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL
4) 取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻
5)天氣較熱時：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時使用冰袋低溫運(yùn)輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時無需加冰袋 運(yùn)輸
3、動物樣本-組織標(biāo)本
3.1凍存樣品取樣要求
1)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）
2)應(yīng)將肌肉表面附著的血液、脂肪、毛皮等非肌肉組織處理干凈
3)直接液氮速凍干冰運(yùn)輸
3.2凍存組織樣品理論用量
組織量 2 g 為佳，最少 1 g；1 g 可滿足 3 個文庫構(gòu)建，最低要求至少 0.2 g
4、動物樣本-細(xì)胞
4.1取樣要求
需要進(jìn)行甲醛交聯(lián)固定后送樣
4.2細(xì)胞樣品量要求
一般來講 2*10^6個細(xì)胞滿足一個 Hi-C 文庫，建議培養(yǎng)到 107 個細(xì)胞用于固定，以保證 試驗的可重復(fù)性， 由于細(xì)胞的數(shù)量可能會影響 Hi-C 試驗的質(zhì)量，因此需要細(xì)胞數(shù)目盡量精確
4.3交聯(lián)細(xì)胞
1) 取 10^7 個新鮮活細(xì)胞置于 15 mL 離心管中，加入 10 mL 的 cold 1×PBS 搖勻，1000 g， 4℃離心 2 min
2)吸棄上清，每管再次加入 10 mL 的 cold 1×PBS 輕混勻，1000g ，4℃離心 2 min
3)吸棄上清，用 10 mL cold 1 × PBS 重懸沉淀，加入適量（570 μL）37%甲醛（終濃度 2%）混勻，室溫放置 10 min(1-2 min 混勻一次)；（注意甲醛需要使用 sigma 等進(jìn)口品 牌，以免影響固定效果，也可以由當(dāng)?shù)劁N售申請實驗室寄送固定試劑）
4)加適量（710 μL）2 M 的甘氨酸（常溫保存）終止反應(yīng)（終濃度 0.125 M），室溫混勻5min，冰上放置15min
5)固定好的細(xì)胞 600 g 4℃ 離心 8 min ，棄上清
6)1 mL cold PBS 重懸沉淀，600g 4℃ 離心 8 min ，去上清
7)液氮速凍干冰運(yùn)輸或-80℃保存
注：做到此步直接液氮速凍，干冰運(yùn)輸，信息單中備注：“細(xì)胞交聯(lián)完成”
5、真菌樣本
5.1凍存樣品—“慢凍快融”或“直接速凍 ”
1) 應(yīng)保證菌體為對數(shù)生長期，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）
2)直接液氮速凍干冰運(yùn)輸
5.2組織樣品理論用量
組織量 1 g 為佳，最少 0.2 g
6、植物樣本
6.1活體植株
1)幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗、組培苗——全部葉片、部分幼嫩莖
2)成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2 片幼嫩葉片
3)取樣量：保證每一個庫的理論用量 1g
4)其它：特殊貴重活體樣品需要客戶提供樣品的種植、保存條件，以保證樣品的正常生長
6.2離體枝條
1)枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉（到樣后會選擇葉片進(jìn)行實驗）；枝條中下端保留部分成熟葉片
2)枝條預(yù)處理：剪斷枝條， 自底端往上約 5 cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋， 袋中 噴水，填充部分空氣，密封袋口
3)枝條運(yùn)輸： 自封袋放入泡沫箱，箱體內(nèi)側(cè)壁放部分冰袋（保證低溫運(yùn)輸），冰袋與自封袋 間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導(dǎo)致樣品被凍傷
4)運(yùn)輸時間：保證 24h內(nèi)到樣，最多不得超過 3天
5)取樣量：保證每一個庫的理論用量1g
6)其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項目，如野外采樣、植株過大等導(dǎo)致的取樣或運(yùn)輸比較困難的項目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實驗；離體枝條如果保存、運(yùn)輸不善會存在部分潛在風(fēng)險：即得到的實驗效果可能會比活體植株檢測結(jié)果 稍差（理論上的潛在風(fēng)險）
6.3凍存植物組織
6.3.1凍存組織風(fēng)險
1)植物組織液氮速凍后容易造成破碎，導(dǎo)致后續(xù)固定等操作無法有效實施
2)植物組織破碎嚴(yán)重時會對核甚至染色體造成物理機(jī)械損傷
6.3.2取樣要求
1)從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干
2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片
3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于 2mL或更大體積的旋蓋凍存管中，每份植物> 1 g，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱
4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存
5)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，植物> 1 g/份，以防部分樣品降解重新取材、制備或送樣
6)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時間不要太長（以凍存時間 1 個月為宜）
7)運(yùn)送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸
6.4其他植物樣本
1)非葉片（活體植株）：有常規(guī)提取經(jīng)驗，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位
2)非葉片（離體植株）：處理與運(yùn)輸與離體枝條相同，有常規(guī)提取經(jīng)驗，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位
3)取樣量：保證每一個庫的理論用量 1 g
4)非葉片樣品適用于葉片難提取的植株或老師的特殊要求，此類樣品DNA提取失敗的風(fēng)險高于葉片樣本，需要銷售與老師交代清楚
6.5植物取樣注意事項
1)建議一次送樣量在 1~4g
2)所有待取的幼嫩組織長勢必須正常（無病蟲害、無營養(yǎng)缺失）
3)對于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第1-2 片嫩葉
4)因為通常裸子植物比被子植物更難選擇適合的解離液，裸子植物的葉子大多為針形、 線形、鱗形，葉片表面有較厚的角質(zhì)層，細(xì)胞內(nèi)次生代謝物多，這對提取完整的細(xì)胞核極為不利，因此，選取
萌發(fā)的新鮮幼苗作為材料會更合適
5)客戶沒有條件寄送活體植物樣本時，可以選擇自己固定，由當(dāng)?shù)劁N售像實驗室申請寄送固定試劑 ( β-巰基乙醇需要老師自己準(zhǔn)備）
7、Hi-C交聯(lián)流程
1)配制NIBuffer工作液 1 ，配制好后置于冰上放置
2)取2g新鮮幼嫩組織樣品，用冰水清洗干凈
3)用剪刀將樣品組織剪碎，放置于50mL 離心管中
4)加入上述配制好的NIBuffer 工作液1
5)加入 2 mL 36%甲醛溶液，室溫條件下，旋轉(zhuǎn)雜交爐中反應(yīng) 90 min
6)加入2.5 mL 2M甘氨酸，連續(xù)手搖 5 min終止交聯(lián)反應(yīng)
7)濾掉液體，用滅菌水清洗至無泡沫為止
8)吸干樣品表面水分，將樣品置于預(yù)冷的50ml離心管中，并將管置于液氮中
9)-80℃保存或干冰寄送
二、百邁客 ATAC-seq 取樣要求
1、生物學(xué)重復(fù)
取樣應(yīng)盡量減少重復(fù)間樣品的差異。盡可能做到重復(fù)在取樣時間、部位、處理條件等方 面保持一致，不同樣本的性別、年齡盡量相同，否則可能會影響實驗結(jié)果的可重復(fù)性及可信度
每個處理至少3個生物學(xué)重復(fù)
2、樣品的保存與運(yùn)輸
簡單處理并標(biāo)記后，應(yīng)立即浸入液氮中速凍，之后保存于-80℃冰箱，以免實驗操作前 樣品降解的可能性
3、取樣要求
3.1組織樣本
1)獲取組織樣本
A.動物：取下新鮮的組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪等雜質(zhì)部分，用預(yù)冷的 1×PBS 溶液漂洗，將組織表面的殘留血液沖洗干凈
B.植物：從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干
2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片
3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中 ，每份組 織>50mg ，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱
4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存
5)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，組織>50mg/份，以防部分樣品降解重新取材、 制備或送樣
6)運(yùn)送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸
7)注意事項
A.昆蟲類樣本建議進(jìn)行饑餓處理后送樣
B.若樣本有微生物污染（細(xì)菌、病毒等），實驗過程無法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會有污染
3.2細(xì)胞樣本
3.2.1貼壁細(xì)胞
3.2.2懸浮細(xì)胞
1)細(xì)胞獲取
A.將貼壁細(xì)胞用移液器緩慢地吹/刮至懸浮狀，或采用胰酶或 EDTA 消化方法制備細(xì)胞懸液
B.確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好
2)按照 50萬個細(xì)胞每管進(jìn)行分裝，準(zhǔn)確標(biāo)記后將分裝好的細(xì)胞 4℃、500G 離心 5min。（到公司后解凍， 由我們再挑選 5萬個相對完整的細(xì)胞核進(jìn)行實驗）
3)小心吸去全部上清，加入 500 μL 預(yù)冷的 1×PBS 溶液洗滌，4℃ 、500G 離心 5min
4)小心吸去全部液體，加入 1 mL 預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，寬口槍頭輕輕吹打細(xì)胞沉淀混勻， 管壁標(biāo)記樣本名稱，慢速梯度降溫凍存
5)梯度降溫可參考：4 度 10min＞負(fù) 20 度 30min＞負(fù) 80 度過夜＞液氮凍存
6)將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入足量的干冰 進(jìn)行運(yùn)輸
7)為確保實驗的順利，建議樣品備份 1-2 份，50萬個/份，以防部分樣品降解重新取材，制備或送樣
注：若細(xì)胞樣本有支原體污染，實驗過程無法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會有污染
3.3全血樣本
1)新鮮血液：每一個樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝 素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，確保
5天內(nèi)運(yùn)至實驗室
2)凍存血液：每一個樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會影響后續(xù)實驗，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，平衡
2 h 后直接液氮速凍，干冰運(yùn)輸
3)注意事項
A.取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染
B.準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）
C.依據(jù)抗凝管的實際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL
D.取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻
E.天氣較熱時：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時使用冰袋低溫運(yùn)輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時無需加冰袋運(yùn)輸
]]>規(guī)格
| 組份 | 規(guī)格 |
| 組織固定液 | 8.75ml(開封后需添加?26.25ml?無水乙醇） |
| Buffer?Ⅰ | 20ml（開封后需添加?20ml?無水乙醇） |
| 組織透明液 | 35ml |
| BufferⅡ | 40ml |
| 石蠟 | 35ml |
| 操作手冊 | 1?份 |
保存方法
試劑盒常溫運(yùn)輸，常溫保存，有效時間截止開封后 60 天。
產(chǎn)品介紹
植物石蠟包埋試劑盒，是一種在保留 RNA 完整性的同時又可進(jìn)行石蠟包埋獲得結(jié)構(gòu)完整性 更好的植物切片的試劑盒。目前常用的植物切片方法主要有徒手切片法、石蠟切片法、冷凍 切片法。徒手切片需要新鮮組織，即取即用無法長時間不存組織；冷凍切片法對于細(xì)胞結(jié)構(gòu) 大含水量較多的組織無法保證組織結(jié)構(gòu)的完整性；常規(guī)石蠟切片法無法保證組織 RNA 完整 性，無法適用于需要長期保存且對 RNA 有要求的試驗。本試劑盒通過低溫短時間固定透明， 并采用特定包埋石蠟可在包埋時有效降低了組織 RNA 降解。
適用組織類型
幼莖、主根（木質(zhì)化程度低）；莖尖分生組織、花芽；生長期籽粒（淀粉含量低）、胚珠、 花苞、葉片
需要而未提供的材料
Tween20、無水乙醇、超純水、移液器、離心管、吸頭、0.22um 針頭式過濾器、真空濃縮儀、 恒溫箱、包埋盒
操作步驟
1 、開始前將組織固定液（確定已添加無水乙醇）吸取 4ml 于 5ml 離心管，放置 4℃預(yù)冷
2 、樣品準(zhǔn)備：用超純水徹底清洗組織表面所有雜質(zhì)，去除目標(biāo)區(qū)域組織周圍其余組織并將組織修整為 適合包埋大小。（為了石蠟更好滲透組織一般組織取材長度不超過 8mm，厚度不超過 5mm， 直徑不超過 1cm；若樣本內(nèi)部有空腔需盡可能暴露空腔，例：包埋花苞樣本時裁去花苞頂端 閉合的花瓣暴露空腔方便石蠟進(jìn)入)
3 、配置 10ml 0.05%Tween 20 ，并進(jìn)行預(yù)冷
4 、將修整好的組織放入 0.05%Tween20 中，室溫孵育 15min。
5 、取出孵育后的組織，將組織表面的試劑用無塵紙沾干。
6 、將組織放入預(yù)冷的組織固定液中，顛倒混勻，使組織完全浸沒并平放于 4℃過夜固定， 固定時間為 15-18h ，固定液體積需要超出組織體積的兩倍。同時將石蠟放置于 38.5℃恒溫 箱進(jìn)行溶解。
7 、吸取 4ml Buffer Ⅰ（確定已添加無水乙醇）置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出固定后的組織，用無 塵紙吸取組織表面多余液體，放入預(yù)冷好的過渡液 1 中，冰上孵育 1h 。同時將 BufferⅡ至于 38.5℃恒溫箱中溶解。
8 、吸取 4ml 組織透明液置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出孵育后的組織，用無塵紙吸取組織表面多 余液體，放入預(yù)冷好的組織透明液中，冰上孵育 1.5h。
*注意：組織在孵育試劑轉(zhuǎn)換的過程中需快速進(jìn)行，以免組織表面試劑揮發(fā)造成組織表面出現(xiàn)皺縮或風(fēng)干
9 、BufferⅡ顛倒混勻后，取 1.2ml 置于 1.5ml 離心管中，取出孵育后的組織，用無塵紙吸取組織表面多余液體后將組織放入 BufferⅡ中，將離心管開蓋放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空1.5h。
*注意：若組織放入 BufferⅡ后 ，試劑出現(xiàn)凝固可置于恒溫箱中溶解后再進(jìn)行抽真空操作， 真空濃縮儀溫度 42℃ , 壓力小于 40KPa ，轉(zhuǎn)速 1300-1500rpm。
10 、將溶解好的石蠟顛倒混勻，取出離心后的組織，將組織放置于盛有 1.2ml 石蠟的 1.5ml 離心管中，之后將其放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空 2h ，間隔 1h 跟換一次新石蠟。
11 、抽真空結(jié)束后取出組織，將石蠟加入包埋盒，并將組織按照切片方向放置，調(diào)整好后放 置于冰上凝固冷凍。
*注意：多個組織需將組織放置于同一平面，且組織需處于包埋盒中間位置，組織任何邊緣不能靠近包埋盒邊緣 ，以免切片組織破碎。
12 、將已凝固的包埋塊小心放于-20℃ , 冷凍 2h。
13 、將已凝固的包埋塊用錫紙包裹小心保存于-80℃ , 避免劇烈磕碰，劇烈磕碰易導(dǎo)致石蠟 塊出現(xiàn)裂縫。
*注意：從-20 轉(zhuǎn)到-80 或者干冰的時候，包埋盒的底部一定不要接觸到干冰或者冰箱底面?？蓪窈屑芷?，讓其緩慢冷卻 ，快速冷凍石蠟可能會產(chǎn)生裂紋
常見問題分析
1 、固定后組織變色或者部分變色
可能原因：組織固定液造成的組織脫色，不影響后續(xù)包埋可繼續(xù)包埋流程。
2 、石蠟溶解后出現(xiàn)白色團(tuán)塊或未能完全溶解
建議措施： ①升高溶解溫度，待完全溶解后在 38.5℃恒溫。
3 、浸蠟后組織靠中心結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)白色，組織邊緣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)透明 可能原因：組織浸蠟不完全
建議措施：加長浸蠟時間，但不可加長超過 1h ，浸蠟時間影響組織 RNA 完整性。
]]>1.1植物組織：CTAB法
1)液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2)向離心管中加入 CTAB，水浴
3)離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4)向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5)加入 75％乙醇，離心，棄上清
6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱
1.2動物組織：SDS法
1)液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2)加入 SDS 溶液，水浴
3)加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4)向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5)向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6)加入 75％乙醇，離心，棄上清
7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱
1.3動物血液：Kurabo 試劑盒法
QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號：40321300101
1.4粗體核酸純化
試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號：10223
試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號：10243
1.5微生物樣本
使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取
2、檢測方法
2.1檢測方法
1)濃度檢測
Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號 NANODROP2000
Qubit：invitrogen ，型號QubitTM3Flurometer
2)完整性檢測（瓊脂糖凝膠電泳）
電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號 EPS600
電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號：HE- 120
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥6μg（單次建庫）
2)濃度≥50ng/ul
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280在1.7-2.2之間，OD260/230在1.7-2.5之間
5)AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點樣孔無或有輕微污染，N/Q在0.9-2.0之間
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
注：特殊物種實驗人員會根據(jù)經(jīng)驗進(jìn)行判斷，具體以檢測報告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)
3、建庫方法
1) DNA 打斷
A.加入0.75-1.5 μg gDNA，補(bǔ)Elution Buffer 至100 μL，將gDNA樣品稀釋到終濃度為7.5 ng/μL -15 ng/μL。小心轉(zhuǎn)移到g-TUBE 管中，4600rpm離心2分鐘
B.重復(fù)離心，直至全部gDNA樣品通過g-TUBE孔洞
C.倒置g-TUBE管，離心2分鐘
D.收集打斷好的gDNA樣品于新的1.5 mL低吸附離心管中
2)PB純化
A.將gDNA樣品稀釋到100 μL，若體積超過100 μL，則不需要稀釋
B.向樣品中中加入 0.45*體積的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）
C.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
D.室溫放置30分鐘，瞬離1秒
E.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
F.使用1.5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
G.瞬離1s，將酒精棄凈
H.向管中加入20 μL 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
I.10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
J.吸取20 μL上清液于新的1.5 mL低吸附離心管中
K.取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測定
3)DNA修復(fù)
A.向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑：
| 試劑 | 體積（μL） |
| Repair buffer | 8 |
| End repair Mix | 4 |
| DNA repair mix | 2 |
| 總體積（Reaction Mix 1） | 14 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.向每個樣品中加入14μL Reaction Mix 1
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
E.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 37℃ | 30 |
| 65℃ | 5 |
| 4℃ | Hold |
4)接頭連接
A.向上述產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| SMRTbell adapter | 4 |
| Ligation mix | 30 |
| Ligation enhancer | 1 |
| 總體積（Reaction Mix 2） | 35 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.向每個樣品中加入35μL Reaction Mix 2
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
E.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 20℃ | 30 |
| 4℃ | Hold |
5)PB純化
A.向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30分鐘）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.室溫放置10分鐘，瞬離1秒
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫5分鐘溶解DNA，瞬離1秒
I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附離心管中
J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測定
6)酶處理
A.向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| Nuclease buffer | 5 |
| Nuclease mix | 5 |
| 總體積（Reaction Mix 3） | 10 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 37℃ | 15 |
| 4℃ | Hold |
7)PB磁珠片段篩選
A.向上述產(chǎn)物中加入3.1*體積的2.85*稀釋的AMPurePB磁珠（室溫平衡30分鐘）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.室溫放置20分鐘，瞬離1秒
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用
E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
I.吸取上清液于新的1.5mL低吸附離心管中
J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復(fù)凍融
4、測序方法
1)最終文庫通過濃度（Qubit）及大?。ˋgilent 5400）的檢測，總量需要大于Smrtlink計算值。
2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對上機(jī)文庫進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
3)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測序儀上進(jìn)行測序
5、實驗用試劑
| 物料名稱 | 廠家 | 存貨代碼 | 規(guī)格 |
| g-TUBE | Covaris | g-TUBE | 10個/盒 |
| SMRTbell Prep Kit 3.0 | PACBIO | 102-182-700 | 24次/盒 |
| Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer | 英濰捷基 | Q32854 | 500次/盒 |
| AMPure PB (5ml)(純化磁珠) | PACBIO | 100-265-900 | 5ml/瓶 |
| SMRTbell cleanup Beads | PACBIO | 102-158-300 | 10000ul/瓶 |
| REVIO SPRQ POLYMERASE KIT | PACBIO | 103-496-900 | 24次/盒 |
| REVIO SPRQ SEQUENCING PLATE | PACBIO | 103-504-900 | 4次/盒 |
| REVIO SMRT CELL TRAY | PACBIO | 102-202-200 | 4張/盒 |
6、實驗用設(shè)備
| 儀器名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 型號 |
| 瞬時離心機(jī) | 天根生化科技（北京）有限公司 | OSE-MC8 |
| ﹣20℃度冰箱 | 青島海爾特種電冰柜有限公司 | BC/BD-629HK |
| 4°C 冰箱 | 海爾 | HYC-360 |
| 渦旋振蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC | vortex-2G560E |
| 基因擴(kuò)增儀 | Appliedbiosystems | veriti96well9902 |
| 恒溫金屬浴 | Eppendorf | ThermoMixer F1.5 |
| 磁力架 | 賽默飛世爾 | DynaMag96Side skirted |
| 測序儀 | Pacbio | Revio |
1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒
3)動物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2、檢測方法
2.1檢測方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進(jìn)行檢測
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時若GX檢測6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3、建庫方法
3.1建庫流程
1) 全長cDNA的合成
A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Total RNA（1ug） | X |
| 3’ SMART?CDS Primer II A (12 μM) | 1 |
| Nuclease-Free Water | 3.5-X |
| Total Volume | 4.5 |
B.輕彈混勻，瞬時離心，置于PCR儀上
C.72℃ 3min，42℃ 2min，72℃到42℃降溫速率設(shè)置為 0.1℃/s
D.在上步反應(yīng)期間，配制如下Mix
| Reagent | Volume（μL） |
| 5X First-Strand Buffer | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.25 |
| dNTP Mix (10 mM ) | 1 |
| SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM) | 1 |
| RNase Inhibitor | 0.25 |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) | 1 |
| Total volume added per reaction | 5.5 |
E.輕彈混勻，瞬時離心，42℃預(yù)熱1min后立即進(jìn)行下步反應(yīng)
F.取5.5μL預(yù)熱的Master Mix加入上步反應(yīng)完成的PCR管中；輕彈混勻，瞬時離心
G.42℃ 90min，70℃ 10min
H.向上述反應(yīng)完成的cDNA產(chǎn)物中加入70 μL Elution Buffer（試劑盒自帶，后邊簡稱EB）進(jìn)行稀釋（總體積80μL）
2)PCR擴(kuò)增
A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Diluted first-strand cDNA | 80 |
| 5’ PCR Primer II A (12 μM) | 8 |
| 5X PrimeSTAR GXL buffe (5X) | 80 |
| dNTP Mix (2.5 mM each) | 32 |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25 U/μL） | 8 |
| Nuclease-free water | 192 |
| Total Volume | 400 |
| Reagent | Volume（μL） |
B.輕彈混勻，瞬時離心，將Mix平均分到0.2mL PCR管中（每管50μL）
C.將PCR管置于PCR儀上，按照PCR條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增
| 98℃ | 30s | |
| 98℃ | 10s | 12cycles |
| 65℃ | 15s | |
| 68℃ | 10min | |
| 98℃ | 5min |
3)PCR純化
A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中
B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.5X（25μL）體積的AMPure?XP磁珠，充分混勻，瞬時離心
C.置于四維旋轉(zhuǎn)儀上混勻結(jié)合15 min
D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加入1.5mL的新配置的80%乙醇，靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.棄盡上清，室溫干燥30 s
H.向兩個1.5mL離心管分別加入22μL的Elution Buffer，輕彈混勻，置于四維旋轉(zhuǎn)儀上5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管
J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量
4)DNA修復(fù)
A. 向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| Repair buffer | 8 |
| End repair Mix | 4 |
| DNA repair mix | 2 |
| 總體積（Reaction Mix 1） | 14 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.向每個樣品中加入14μL Reaction Mix 1
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s
E.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 37℃ | 30 |
| 65℃ | 5 |
| 4℃ | Hold |
5)接頭連接
A.向上述產(chǎn)物中加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| SMRTbell adapter | 4 |
| Ligation mix | 30 |
| Ligation enhancer | 1 |
| 總體積（Reaction Mix 2） | 35 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.向每個樣品中加入35μL Reaction Mix 2
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s
E.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 20℃ | 30 |
| 4℃ | Hold |
6)PB純化
A.向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30min）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.室溫放置10min，瞬離1s
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫5min溶解DNA，瞬離1s
I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附離心管中
J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測定
4、測序方法
1)使用Sequel II Binding kit 2.1（Pacbio，USA） 對上機(jī)文庫進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
2)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行AMPure PB（Pacbio，USA）純化后置于SequelII（Pacbio，USA）測序儀上進(jìn)行測序
5、實驗試劑
| 物料名稱 | 廠家 | 貨號 |
| SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit | TAKARA | 634925 |
| Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer | 英濰捷基 | Q32854 |
| Agencourt? AMPure? XP | Beckman | A63882 |
| SMRTbell Prep Kit 3.0 | PACBIO | 102-182-700 |
| SMRTbell cleanup Beads | PACBIO | 102-158-300 |
| AMPure PB | PACBIO | 102-182-500 |
| Sequel II Binding kit 2.1 | PACBIO | 101-626-600 |
| Sequel II Sequencing 2.0 Bundle (5 pack of 4 rxn plates) | PACBIO | 101-849-000 |
| SMRT Cell 8M | PACBIO | 101-389-001 |
6、實驗設(shè)備
| 儀器名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 型號 |
| 瞬時離心機(jī) | 天根生化科技（北京）有限公司 | OSE-MC8 |
| ﹣20℃度冰箱 | 青島海爾特種電冰柜有限公司 | BC/BD-629HK |
| 4°C 冰箱 | 海爾 | HYC-360 |
| 渦旋振蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC | vortex-2G560E |
| 基因擴(kuò)增儀 | Appliedbiosystems | veriti96well9902 |
| 恒溫金屬浴 | Eppendorf | ThermoMixer F1.5 |
| 磁力架 | 賽默飛世爾 | DynaMag96Side skirted |
| 測序儀 | Pacbio | SequelII |
1、提取方法
1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒
3)動物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2、檢測方法
2.1檢測方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進(jìn)行檢測
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時若GX檢測6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3、建庫方法
3.1建庫流程
1) 全長cDNA的合成
A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Total RNA | X |
| Is-Seq RT Primer mix | 2 |
| Nuclease-free Water | 7-X |
| Total Volume | 9 |
B.輕彈混勻，瞬時離心，置于PCR儀上
C.70℃反應(yīng) 5 min ，20℃ hold（80℃熱蓋），立即進(jìn)行下步反應(yīng)
D.在上步反應(yīng)期間，配制如下Mix
| Reagent | Volume（μL） |
| Iso-Seq RT buffer | 5 |
| Iso-Seq RT enzyme mix | 2 |
| Nuclease-free Water | 3 |
| Total Volume | 10 |
E.輕彈混勻，瞬時離心
F.取 cDNA 反應(yīng)產(chǎn)物 9 μL 中加入 10 μL 上述 Mix
G.輕彈混勻，瞬時離心
H.42℃反應(yīng) 45 min ，20℃ hold（52℃熱蓋），立即進(jìn)行下步反應(yīng)
I.向反應(yīng)完的產(chǎn)物中加入 2 μL Iso-Seq template switch oligo ，總體積達(dá)到 21 μL
J.輕彈混勻，瞬時離心
K.42℃反應(yīng) 15 min ，4℃ hold（52℃熱蓋）
2)磁珠純化
A.將上步反應(yīng)產(chǎn)物（21μL），移入新的1.5mL低吸離心管中，加入29μLElutionBuffer
B.向1.5mL離心管中加入1.3×（65μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻
C.室溫孵育10min
D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.瞬時離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管中加入21μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管
3)cDNA擴(kuò)增
A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑
Reagent Volume（μL）
| Reagent | Volume（μL） |
| Iso-Seq cDNA PCR mix | 25 |
| Iso-Seq cDNA amplification prime | 2 |
| Total Volume | 27 |
B.向純化產(chǎn)物中加入27μl上述mix
C.加入2μlIso-SeqprimerBarcode，總體積達(dá)到50μl
D.充分輕彈混勻，瞬時離心
E.按照下面反應(yīng)程序反應(yīng)
| 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
| 98℃ | 45s | 1 |
| 98℃ | 10s | 12 |
| 60℃ | 15s | |
| 72℃ | 3min | |
| 72℃ | 5min | 1 |
| 4℃ | Hold | 1 |
4)磁珠純化
A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中
B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.9X（45μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時離心
C.室溫孵育10min
D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加入200μl新配置的80%乙醇，靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管
J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總
5)混樣
A.根據(jù) Qubit 檢測結(jié)果、數(shù)據(jù)需求量進(jìn)行混樣，混樣總量達(dá)到 55ng ，置于冰上
B.輕彈混勻，瞬時離心
6)kinnex PCR
A.分別加入以下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Nuclease-free Water | 88-X |
| Kinnex PCR mix | 110 |
| 55 ng cDNA | X |
| Total Volume | 198 |
B.分 22.5 μL 的 Mix 產(chǎn)物加入到 8 連排管中
C.每管中加入2.5μL Kinnex primer mix A-HQ
D.輕彈混勻，瞬時離心
E.按照下面反應(yīng)程序反應(yīng)
| 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
| 98℃ | 3min | 1 |
| 98℃ | 20s | 9 |
| 68℃ | 30s | |
| 72℃ | 4min | |
| 72℃ | 5min | 1 |
| 4℃ | Hold | 1 |
7)磁珠純化
A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中，總體積184μL
B.向1.5mL離心管中加入1.05X（193μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時離心
C.室溫孵育10min
D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加入200μl的新配置的80%乙醇，靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管
J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量
8)串聯(lián)
A.分別加入以下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Nuclease-free Water | 39-X |
| 純化產(chǎn)物 5 μg | X |
| Kinnex adapter bc | 2 |
| Total | 41 |
B.配置以下mix
| Reagent | Volume（μL） |
| Kinnex array and repair buffer | 7 |
| Kinnex enzyme | 4 |
| Kinnex ligase | 6 |
| Total | 17 |
C.向41μL反應(yīng)產(chǎn)物中加入17μL的mix，輕彈混勻，瞬時離心
D.45℃反應(yīng)60min，4℃hold（52℃熱蓋）
E.加入2μLDNArepairmix，輕彈混勻，瞬時離心
F.45℃反應(yīng)30min，4℃hold（60℃熱蓋）
9)磁珠純化
A.將上步反應(yīng)產(chǎn)物移入新的1.5mL低吸離心管中，總體積60μL
B.向1.5mL離心管中加入1×（60μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻
C.室溫孵育10min
D.瞬時離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.瞬時離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管中加入40μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管
J.使用Qubit檢測濃度
10)酶處理
A.向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| Nuclease buffer | 5 |
| Nuclease mix | 5 |
| 總體積（Reaction Mix 3） | 10 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.孵育
| 溫度 | 時間（min） |
| 37℃ | 15 |
| 4℃ | Hold |
11)PB磁珠片段篩選
A.向上述產(chǎn)物中加入3.1*體積的 2.85*稀釋的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.室溫放置20min，瞬離1s
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用
E.使用1.5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫10-15min溶解DNA，瞬離1s
I.吸取上清液于新的1.5 mL低吸附離心管中
J.取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復(fù)凍融
4、測序方法
1)最終文庫通過濃度（Qubit）檢測，總量需要大于Smrtlink
2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對上機(jī)文庫進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
3)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測序儀上進(jìn)行測序
5、實驗試劑
| 物料名稱 | 廠家 | 貨號 |
| SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit | TAKARA | 634925 |
| Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer | 英濰捷基 | Q32854 |
| Agencourt? AMPure? XP | Beckman | A63882 |
| SMRTbell Prep Kit 3.0 | PACBIO | 102-182-700 |
| SMRTbell cleanup Beads | PACBIO | 102-158-300 |
| AMPure PB | PACBIO | 102-182-500 |
| REVIO SPRQ POLYMERASE KIT | PACBIO | 103-496-900 |
| REVIO SPRQ SEQUENCING PLATE | PACBIO | 103-504-900 |
| REVIO SMRT CELL TRAY | PACBIO | 102-202-200 |
6、實驗設(shè)備
| 儀器名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 型號 |
| 瞬時離心機(jī) | 天根生化科技（北京）有限公司 | OSE-MC8 |
| ﹣20℃度冰箱 | 青島海爾特種電冰柜有限公司 | BC/BD-629HK |
| 4°C 冰箱 | 海爾 | HYC-360 |
| 渦旋振蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC | vortex-2G560E |
| 基因擴(kuò)增儀 | Appliedbiosystems | veriti96well9902 |
| 恒溫金屬浴 | Eppendorf | ThermoMixer F1.5 |
| 磁力架 | 賽默飛世爾 | DynaMag96Side skirted |
| 測序儀 | Pacbio | Revio |