1.1適用范圍
本指南介紹百邁客動(dòng)物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過長等
1.2提取風(fēng)險(xiǎn)提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取
2、組織送樣量要求
注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量
2.1常規(guī)植物組織送樣要求
| 物種 | 舉例說明 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g） | |||||
| 葉子 | 根 | 莖 | 花 | 果實(shí) | 種子 | ||||
| 普通禾本科植物 | 水稻 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | 2 | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 玉米、小麥等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – | |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 豆科草本植物 | 大豆、苜蓿、落花生等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.3 | 0.3 | |||
| 芭蕉科植物 | 香蕉、芭蕉、旅人蕉等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 松科植物 | 馬尾松、云杉、濕地松等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 瑞香科植物 | 狼毒、結(jié)香等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 薯類植物植物 | 木薯、番薯、土豆、山藥等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 其他落葉喬木 | 楊樹、梧桐、懸鈴木等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 水果類 | 葡萄、檸檬、龍眼等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 薔薇科 | 桃、蘋果、梨、草莓等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.2 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 1 | 0.5 | |||
| 物種 | 舉例說明 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g） | |||||
| 葉子 | 根 | 莖 | 花 | 果實(shí) | 種子 | ||||
| 中藥 | 人參、三七、何首烏等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.3 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.3 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 仙人掌科 | 火龍果、仙人掌（取外皮）等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 | 0.3 | 0.5 | 0.15 | 0.5 | 0.5 | |||
| 蒺藜科 | 白刺 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| SLAF | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 獼猴桃科 | 獼猴桃 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.3 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 大型真菌 | 蘑菇，靈芝，木耳等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.3 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.3 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | – | – | – | – | – | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 真核小RNA | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 殼斗科 | 板栗、櫟樹、 青岡等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 槭樹科 | 雞爪槭，元寶槭，糖槭等 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | – | 0.3 | |||
| 錦葵科 | 蜀葵，秋葵 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.5 | 0.3 | |||
| 石斛 | 石斛（干樣、炮制） | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | 2 | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 真核小RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.15 | 0.3 | 0.3 | |||
| 藻類 | 海帶、紫菜、微藻、海藻、抑食金球藻 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 | – | – | – | – | – |
| 外顯子 | 0.5 | – | – | – | – | – | |||
| 甲基化 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | – | – | – | – | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1.5 | – | – | – | – | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | – | – | – | – | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
| 真核小RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | – | – | – | |||
3、核酸送樣要求
1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型
2)如果您開展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中
3.1二代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | SLAF | 重測(cè)序 | 甲基化 | 外顯子 | FFPE | PCR產(chǎn)物 | PCR-free | chip-seq |
| 濃度ng/ul | 5 | 1 | 5 | 6 | 14 | 0.6 | 40 | 1 |
| 總量ug | 1.5 | 0.1 | 1 | 0.1 | 0.25 | 0.1 | 1 | 0.06 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 15 | 20 | 15 | 15 | 15 |
3.2三代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | ONT動(dòng)植物基因組 | PB動(dòng)植物基因組 | 超長 |
| 濃度ng/ul | 40 | 100 | 50 | 50 |
| 總量ug | 4 | 10 | 15 | 15 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 50 |
3.3RNA類送樣量要求
1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量
2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展
3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品
4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈
5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按照送樣建議來送樣
| 項(xiàng)目類型 | 初檢結(jié)果（濃度、體積、純度） | 樣品狀態(tài) | ||
| 濃度（ng/ul） | 總量（ug） | 體積(ul) | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 20 | 1 | 15 | 正常 |
| 真核小RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
| 長鏈非編碼RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
4、樣品制備保存指南
4.1常規(guī)植物類樣本（不含藻類）制備流程
由于老葉或其它組織DNA&RNA含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對(duì)較高，因此，為降低DNA&RNA提取難度并減少污染物干擾，請(qǐng)盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外藻類組織中的水分會(huì)影響提取得率，取樣時(shí)需將組織樣中的水分吸干。建議在采集樣本之前，將樣本置于黑暗環(huán)境24-48小時(shí)后再制備樣本（停止光合作用，減少代謝干擾），新鮮組織樣采樣流程如下：
1)用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再從植物體上取下新鮮組織（注：如果是需要進(jìn)行處理，請(qǐng)?jiān)诨铙w上進(jìn)行處理后再取樣
2)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準(zhǔn)備好的凍存管中
3)處理好的組織樣本混合均勻后立即保存于提前標(biāo)記編號(hào)、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管
4)液氮凍存前將樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，處理好的組織樣本混合均勻后保存于提前標(biāo)記編號(hào)、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管
5)迅速置于液氮中冷凍 1~2 h，然后按照順序依次放入樣品盒中（不建議自封袋送樣），轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存（禁止亂放，尤其是項(xiàng)目中樣品個(gè)數(shù)較多時(shí)），干冰運(yùn)輸
注：植物組織不建議使用組織保護(hù)液保存。對(duì)于一些需要?jiǎng)內(nèi)シN皮處理的，因樣品速凍后無法準(zhǔn)確剔除，如有需要?jiǎng)內(nèi)シN皮的老師須自行操作
4.2Ultra Long ONT類植物樣本
4.2.1植物組織選取及取樣步驟
1)準(zhǔn)備剪刀、鑷子、錫箔紙，選取新鮮幼嫩的組織， 例如幼嫩的葉片（也可以是新長出的幼嫩根尖）
2)除去枯萎的，損傷的部分，除去莖，葉柄和粗的葉脈
3)將組織清理干凈，可放在容器中用水沖洗，除去雜質(zhì)和其他殘余碎片
4)將清洗干凈的樣本倒在吸水紙上，再蓋上一張吸水紙用手輕輕壓幾次（注意不要太用力損傷 葉片），水盡可能除去
5)將葉片稱量一下，每0.5g/管（推薦使用 50ml 離心管）裝好，標(biāo)注樣本名稱，日期，準(zhǔn)確重量
6)放入液氮快速冷凍 10min，轉(zhuǎn)入-80 °C 冰箱保存，干冰運(yùn)輸
7)葉片剪下后的稱量等操作，請(qǐng)?jiān)?10min 內(nèi)完成，時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致葉片失水不可用，部分地區(qū)氣溫較高失水更快，操作時(shí)間需更短
4.2.2注意事項(xiàng)與說明
1)葉片要幼嫩的、新鮮的 、完整的（不要有損傷），可用手對(duì)比老葉和嫩葉的觸感，嫩葉的觸感非常柔軟
2)林木 、灌木類的請(qǐng)根據(jù)生長周期來確定采樣時(shí)間， 最好是發(fā)芽后長出來的嫩葉
3)禾本科黃化苗 1-2 周，最好有專門的黃化經(jīng)驗(yàn)，黃化太過會(huì)造成細(xì)胞核難提取 。如果不會(huì)黃化就送 1-2 周剛長出來的葉片，具體生長時(shí)間需根據(jù)植物的生長狀態(tài)判斷
4)組培苗，不建議直接使用，盡量移植到土壤中培育出植株，取新長出的幼嫩葉片，若使用組培苗送樣，請(qǐng)客戶多準(zhǔn)備備份樣本
5)送樣前請(qǐng)拍照記錄樣品狀態(tài)
5、注意事項(xiàng)
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取
1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)
2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)
3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解
4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解
6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸
7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況
8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性
9)長年保存的組織：保存時(shí)間超過一年的組織不建議送樣
10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取
11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)
6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)
6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險(xiǎn)
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差
6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常
6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染
1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量
2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題
3)文庫構(gòu)建失敗
4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
6.4目標(biāo)RNA含量低
1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗
2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高
]]>1、前言
1.1適用范圍
本指南介紹百邁客動(dòng)物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過長等
1.2提取風(fēng)險(xiǎn)提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取
2、組織送樣量要求
注1：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量
注2：由于骨骼含有大量鈣鹽和礦物質(zhì)，細(xì)胞密度低，核酸含量較少；毛發(fā)暴露在外界環(huán)境，容易受到紫外線、溫度變化、微生物影響，導(dǎo)致核酸降解，毛干核酸含量低，毛囊周圍細(xì)胞多難獲取，為了保證您實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，這兩個(gè)部位不建議送組織樣，建議自行提取
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g/ml/個(gè)） | |||||||||
| 心臟 | 肝臟 | 脾臟 | 腎臟 | 腦 | 肌肉 | 腸道 | EDTA抗凝血液 | PAXgene管送樣血液 | 細(xì)胞 | |||
| 人 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 |
| 外顯子 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 5*10e6 | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 鼠 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 |
| 外顯子 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | 0.3 | – | 1*10e6 | ||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.2 | 0.2 | 0.5 | – | 5*10e6 | ||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 5*10e6 | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 5*10r6 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.5 | 10 | 3*10r6 | ||
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（g） |
| 皮膚 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | ||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | ||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | ||
| 毛發(fā) | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | ||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | ||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | ||
| 骨骼 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | ||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | ||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 |
3、核酸送樣要求
1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒ǎ员苊舛嗵?、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型
2)如果您開展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中
3.1二代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | SLAF | 重測(cè)序 | 甲基化 | 外顯子 | FFPE | PCR產(chǎn)物 | PCR-free | chip-seq |
| 濃度ng/ul | 5 | 1 | 5 | 6 | 14 | 0.6 | 40 | 1 |
| 總量ug | 1.5 | 0.1 | 1 | 0.1 | 0.25 | 0.1 | 1 | 0.06 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 15 | 20 | 15 | 15 | 15 |
3.2三代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | ONT動(dòng)植物基因組 | PB動(dòng)植物基因組 | 超長 |
| 濃度ng/ul | 40 | 100 | 50 | 50 |
| 總量ug | 4 | 10 | 15 | 15 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 50 |
3.3RNA類送樣量要求
1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量
2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展
3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品
4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈
5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按照送樣建議來送樣。
| 項(xiàng)目類型 | 初檢結(jié)果（濃度、體積、純度） | 樣品狀態(tài) | ||
| 濃度（ng/ul） | 總量（ug） | 體積(ul) | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 20 | 1 | 15 | 正常 |
| 真核小RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
| 長鏈非編碼RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
4、樣品制備保存指南
4.1常規(guī)動(dòng)物類樣本
送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對(duì)較高的組織，樣本制備優(yōu)先級(jí)：血液>內(nèi)臟>肌肉?；铙w取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈
4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）
1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以內(nèi)）
2)活體取下新鮮的組織
3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)
6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
7)干冰運(yùn)輸
4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞和研磨后的組織適用）
1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量
2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送
3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣
4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）
1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊
2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存
3)RNAlater? Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存
4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存
5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存
注：如果組織較小，建議優(yōu)先選擇此方式送樣
4.2全血
DNA類產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時(shí)間過長。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿。
4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
注1：血液采集管請(qǐng)盡量不要用需專門對(duì)應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對(duì)應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）
注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎
4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程
4.2.2.1新鮮血液
1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期，體積）
2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置
3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)人員手中不可超過 3 天
4.2.2.2凍存血液
1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次
2)哺乳動(dòng)物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）
3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）
4)做好標(biāo)記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送
4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程
4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動(dòng)物優(yōu)先選擇該方式送樣）
1)PAXgene管的介紹
在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測(cè)試中，采集全血是第一步。 這類測(cè)試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時(shí)內(nèi)迅速降解。 此外，通過基因誘導(dǎo)過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對(duì)數(shù)量估計(jì)過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時(shí)，PAXgene 血液 RNA 管可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)和定量
2)采集前準(zhǔn)備
A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）
B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）
C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）
D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）
3)采集流程
A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識(shí)別標(biāo)簽
B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管
C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管
D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次
E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲(chǔ) PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時(shí)，最多 72 小時(shí)，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲(chǔ)溫度，請(qǐng)參見“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息
4)注意事項(xiàng)
A.確保采血管在有效期內(nèi)，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）
B.不可預(yù)先打開管蓋，避免穩(wěn)定劑失效
C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議
D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會(huì)導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯(cuò)誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯(cuò)誤或產(chǎn)品性能欠佳
E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA
4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
4.3細(xì)胞
4.3.1貼壁細(xì)胞
4.3.1.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.3.1.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細(xì)胞溶解物的黏度來判斷。在細(xì)胞剛?cè)芙鈺r(shí)，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會(huì)消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加裂解液。裂解液加入量過少，會(huì)導(dǎo)致抽提的 RNA 降解
4.3.2懸浮細(xì)胞
4.3.2.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.3.2.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
5、注意事項(xiàng)
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取
1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)
2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)
3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解
4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解
6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸
7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況
8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性
9)長年保存的組織：保存時(shí)間超過一年的組織不建議送樣
10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取
11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)
6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)
6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險(xiǎn)
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差
6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常
6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染
1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量
2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題
3)文庫構(gòu)建失敗
4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
6.4目標(biāo)RNA含量低
1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗
2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高
]]>1、前言
1.1適用范圍
本指南介紹百邁客動(dòng)物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿足建庫測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過長等
1.2聲明
對(duì)于危害程度為第一、二類的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織樣。對(duì)于危害程度為三、四類的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過銷售或運(yùn)營與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)負(fù)責(zé)人溝通，確認(rèn)無高致病和傳染性且能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)后再安排樣品寄送。危害程度的判定標(biāo)準(zhǔn)具體參見《人間傳染的病原微生物名錄》
1.3提取風(fēng)險(xiǎn)提示
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取
2、組織送樣量要求
注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿足提取一次的量，如樣品經(jīng)過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量
2.1常規(guī)動(dòng)物類組織送樣要求
| 物種 | 舉例說明 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 組織部位（g） | ||||||
| 心臟 | 肝臟 | 脾臟 | 腎臟 | 腦 | 肌肉 | 腸道 | ||||
| 常規(guī)動(dòng)物 | 哺乳動(dòng)物、禽類、爬行動(dòng)物 | DNA | 重測(cè)序 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 |
| SLAF | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 甲基化 | 0.2 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | – | 0.2 | 0.2 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.5 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.5 | – | 0.5 | 0.5 | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | 0.5 | 0.5 | 1 | – | 1 | 1 | |||
| Ultra Long ONT | – | 1 | 1 | 1 | – | 1 | 1 | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |||
| 真核小RNA | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | |||
| 節(jié)肢動(dòng)物 | 昆蟲（蚊子、蒼蠅、螞蟻） | DNA | 重測(cè)序 | – | – | – | – | – | 0.2 | – |
| SLAF | – | – | – | – | – | 0.2 | – | |||
| 甲基化 | – | – | – | – | – | 0.2 | – | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 真核小RNA | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 長鏈非編碼RNA | – | – | – | – | – | 0.2 | 0.2 | |||
| 水產(chǎn)動(dòng)物 | 蝦、蟹、魚等（針對(duì)微小組織類型 需要在干冰上進(jìn)行，注意操作時(shí)間不宜過長） | DNA | 重測(cè)序 | – | – | – | – | – | 0.3 | – |
| 外顯子 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| 甲基化 | – | – | – | – | – | 0.3 | – | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | – | – | – | – | – | 1 | – | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | – | – | – | – | – | 1.5 | – | |||
| Ultra Long ONT | – | – | – | – | – | 1.5 | – | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 真核小RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | |||
| 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（g） |
| 皮膚 | DNA | 重測(cè)序 | 0.5 |
| 外顯子 | 0.5 | ||
| 甲基化 | 0.5 | ||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 1 | ||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 1 | ||
| PB動(dòng)植物基因組 | 2 | ||
| Ultra Long ONT | – | ||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | ||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.3 | ||
| 真核小RNA | 0.3 | ||
| 長鏈非編碼RNA | 0.3 |
2.2動(dòng)物類血液送樣量
| 組織部位 | 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（ml） |
| 全血 | 哺乳動(dòng)物 | DNA-EDTA抗凝 | 重測(cè)序 | 0.3 |
| SLAF | 0.3 | |||
| 甲基化 | 0.3 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.5 | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 0.5 | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 1 | |||
| Ultra Long ONT | 1 | |||
| RNA-PAXgen管送樣 | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 10 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 10 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 10 | |||
| 真核小RNA | 10 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 10 | |||
| RNA-EDTA抗凝 | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 | |||
| 禽類 | DNA-EDTA抗凝 | 重測(cè)序 | 0.05 | |
| SLAF | 0.05 | |||
| 甲基化 | 0.05 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 0.1 | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 0.1 | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 0.1 | |||
| Ultra Long ONT | 0.1 | |||
| RNA-EDTA抗凝 | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 0.5 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 0.5 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 0.5 | |||
| 真核小RNA | 0.5 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 0.5 |
2.3動(dòng)物類細(xì)胞送樣量
| 組織部位 | 物種 | 核酸類型 | 產(chǎn)品類型 | 送樣量（個(gè)） |
| 細(xì)胞 | DNA | 重測(cè)序 | 1*10e6 | |
| SLAF | 1*10e6 | |||
| 甲基化 | 1*10e6 | |||
| ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | 5*10e6 | |||
| ONT動(dòng)植物基因組 | 5*10e6 | |||
| PB動(dòng)植物基因組 | 5*10e6 | |||
| Ultra Long ONT | 1*10e7 | |||
| RNA | 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 5*10e6 | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 5*10e6 | |||
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 3*10e6 | |||
| 真核小RNA | 3*10e6 | |||
| 長鏈非編碼RNA | 3*10e6 | |||
3、核酸送樣要求
1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類型
2)如果您開展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中
3.1二代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | SLAF | 重測(cè)序 | 甲基化 | 外顯子 | FFPE | PCR產(chǎn)物 | PCR-free | chip-seq |
| 濃度ng/ul | 5 | 1 | 5 | 6 | 14 | 0.6 | 40 | 1 |
| 總量ug | 1.5 | 0.1 | 1 | 0.1 | 0.25 | 0.1 | 1 | 0.06 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 15 | 20 | 15 | 15 | 15 |
3.2三代DNA送樣量要求
| 產(chǎn)品類型 | ONT動(dòng)植物重測(cè)序 | ONT動(dòng)植物基因組 | PB動(dòng)植物基因組 | 超長 |
| 濃度ng/ul | 40 | 100 | 50 | 50 |
| 總量ug | 4 | 10 | 15 | 15 |
| 體積ul | 15 | 15 | 15 | 50 |
3.3RNA類送樣量要求
1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量
2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展
3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品
4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈
5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按
| 項(xiàng)目類型 | 初檢結(jié)果（濃度、體積、純度） | 樣品狀態(tài) | ||
| 濃度（ng/ul） | 總量（ug） | 體積(ul) | ||
| 全長轉(zhuǎn)錄組（PB） | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 全長轉(zhuǎn)錄組（ONT) | 100 | 1 | 15 | 正常 |
| 二代轉(zhuǎn)錄組 | 20 | 1 | 15 | 正常 |
| 真核小RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
| 長鏈非編碼RNA | 80 | 1 | 15 | 正常 |
4、樣品制備保存指南
4.1常規(guī)動(dòng)物類樣本（脊柱動(dòng)物、哺乳動(dòng)物）
常規(guī)動(dòng)物主要包括脊椎動(dòng)物組織樣本主要包括：哺乳動(dòng)物、禽類、爬行動(dòng)物以及兩棲動(dòng)物。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對(duì)較高的組織，樣本制備優(yōu)先級(jí)：血液>內(nèi)臟>肌肉。活體取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈
4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）
1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以內(nèi)）
2)活體取下新鮮的組織
3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈
4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>
5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)
6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
7)干冰運(yùn)輸
4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞組織適用）
1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量
2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送
3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣
4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）
1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊
2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存
3)RNAlater? Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存
4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存
5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存
4.2全血
DNA類產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時(shí)間過長。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿
4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
注1：血液采集管請(qǐng)盡量不要用需專門對(duì)應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對(duì)應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）
注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎
4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程
4.2.2.1新鮮血液
1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期，體積）
2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置
3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)人員手中不可超過 3 天
4.2.2.2凍存血液
1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次
2)哺乳動(dòng)物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）
3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）
4)做好標(biāo)記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送
4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程
4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動(dòng)物優(yōu)先選擇該方式送樣）
1)PAXgene管的介紹
在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測(cè)試中，采集全血是第一步。 這類測(cè)試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時(shí)內(nèi)迅速降解。 此外，通過基因誘導(dǎo)過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對(duì)數(shù)量估計(jì)過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時(shí)，PAXgene 血液 RNA 管可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)和定量
2)采集前準(zhǔn)備
A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）
B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）
C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）
D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）
3)采集流程
A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識(shí)別標(biāo)簽
B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管
C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管
D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次
E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲(chǔ) PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時(shí)，最多 72 小時(shí)，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲(chǔ)溫度，請(qǐng)參見“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息
4)注意事項(xiàng)
A.確保采血管在有效期內(nèi)，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）
B.不可預(yù)先打開管蓋，避免穩(wěn)定劑失效
C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議
D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會(huì)導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯(cuò)誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯(cuò)誤或產(chǎn)品性能欠佳
E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA
4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程
1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本
2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說明要求操作）
3)干冰運(yùn)輸
4.3昆蟲
1)昆蟲樣本，需進(jìn)行表面微生物的清洗，某些吸血性昆蟲，例如蚊子，血吸蟲，該類型樣本可能存在外源污染，需要進(jìn)行切腹，去除腸道處理。較大個(gè)體的選取不帶腸道部分的組織，將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大?。瑢?duì)于較小個(gè)體只能用整個(gè)個(gè)體的，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（注意保證昆蟲的活性）
2)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以內(nèi)）
3)轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
注1：小型昆蟲組織務(wù)必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時(shí)該類樣本因只滿足一次或低于常規(guī)一次提取用量，我們無法保證100%提取合格
注2：蜜蜂送樣時(shí)盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個(gè)蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不建議送實(shí)驗(yàn)室剔除，因?yàn)榻M織速凍過之后再剔除會(huì)化凍，提取降解的可能性較大
4.4微生物
4.4.1細(xì)菌
1)顯微鏡下觀察細(xì)菌生長狀態(tài)，建議收集生長期處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌
2)將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min
3)棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸
5)以下為不規(guī)范送樣圖片：菌體平板（左圖），菌液送樣（右圖）
4.4.2真菌
4.4.2.1單細(xì)胞真菌
單細(xì)胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×107個(gè)，以 5×106-1× 107個(gè)為宜。您要做的項(xiàng)目要求送樣量較大時(shí)，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨(dú)保存
1)顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，最好收集生長期處于對(duì)數(shù)期的酵母菌
2)將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min
3)棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存
4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸
4.4.2.2多細(xì)胞真菌（大型真菌）
1)取完整菌體，先用大量清水沖洗其表面雜質(zhì)，再用純水清洗一遍，使用吸水紙吸干表面的水份后，用剪刀將組織分割為小塊，做好標(biāo)記（樣本名稱，日期,，體 積）放液氮里速凍，干冰寄送
2)菌絲：將無菌棉簽輕輕觸碰菌落或菌斑的中心部分，避免碰到邊緣或其他細(xì)菌來源。然后，將棉簽迅速劃過培養(yǎng)基表面，以收集菌絲轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。(可根據(jù)樣品量收集多管或使用15mL螺旋管收集）
4.5水產(chǎn)類
水產(chǎn)類包括淡水魚類、海水魚類、貝類、藻類。送樣需要選擇新鮮采集的樣本
1)優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時(shí)應(yīng)選取核酸含量較多的部位
2)取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體
3)活體取材后用預(yù)冷的0.9%生理鹽水進(jìn)行清洗，去除血漬和污物
4)將樣品分割成50 mg左右的小塊（約黃豆大?。?，樣品分割和處理時(shí)應(yīng)盡量在冰上進(jìn)行，防止樣品降解。避免裝樣太滿以至凍裂，造成樣品污染
注：水產(chǎn)類樣品需盡量保證為新鮮個(gè)體。盡量避免寄送保存時(shí)間較長或經(jīng)過反復(fù)凍融的組織樣品。針對(duì)軟體動(dòng)物可先使用75%的乙醇進(jìn)行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運(yùn)輸；針對(duì)刺胞動(dòng)物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取
4.6細(xì)胞
4.6.1貼壁細(xì)胞
4.6.1.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.6.1.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.6.2懸浮細(xì)胞
4.6.2.1液氮速凍法
1)確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）
2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中
3)離心（依據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
4.6.2.2TRIzol裂解法
1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol
2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解
3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送
5、注意事項(xiàng)
核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。
1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)
2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)
3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解
4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存
5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解
6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸
7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況
8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性
9)長年保存的組織：保存時(shí)間超過一年的組織不建議送樣
10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取
11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)
6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)
6.1樣本總量不足、濃度過低存在風(fēng)險(xiǎn)
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)
1)文庫構(gòu)建失敗
2)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常
4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差
5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差
6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常
6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染
1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問題質(zhì)量
2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫隨機(jī)性差等問題
3)文庫構(gòu)建失敗
4)文庫產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足
6.4目標(biāo)RNA含量低
1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫失敗
2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高
]]>一、百邁客Hi-C取樣要求
1、基本要求
1.1安全
1)人身安全：現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下（采取一定防護(hù)后），樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)人員本身無傷害
2)環(huán)境安全：樣品對(duì)室內(nèi)、室外環(huán)境無影響（以免因?yàn)椴恍⌒膶?dǎo)致一些活體樣本進(jìn)入外界 環(huán)境造成不良影響）
1.2無污染
1)植物樣本不得有其它植物的污染，不得有病害，不得有蟲害（尤其是一些肉眼不容易發(fā) 現(xiàn)的蟲卵等）
2)全血樣品不得引入取血物種本身攜帶的病菌、病毒等潛在污染
1.3依據(jù)“理論”&“實(shí)踐”
1)“理論”：基于各種實(shí)驗(yàn)原理的理論依據(jù)
2)“實(shí)踐”：基于 BMK 本身積累的多物種、多樣品的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)
1.4送樣說明
1)客戶或銷售人員應(yīng)將樣本的信息詳細(xì)說明，所有樣品必須標(biāo)注好關(guān)鍵樣品信息：如物種名 稱、樣品名稱、到樣日期、是否需要返樣等
2)樣品信息單必須早于或與樣品同時(shí)到達(dá)公司，一則方便樣品中心錄樣，二則方便項(xiàng)目盡快 啟動(dòng)
3)因?yàn)闃悠肥状稳硬蛔恪①|(zhì)量不好或信息單未及時(shí)到位造成項(xiàng)目進(jìn)度延后時(shí)需要由客戶或 銷售部承擔(dān)相關(guān)責(zé)任（特殊項(xiàng)目除外）
4)因公司內(nèi)部培養(yǎng)條件不能同時(shí)滿足各種物種的生長需求，因此，送達(dá)活體樣品應(yīng)該盡量是 送到即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的樣品（量足，質(zhì)好），不建議在公司保存過長時(shí)間，防止培養(yǎng)樣本死亡
5)所有需要特殊關(guān)注的樣品，在華開任務(wù)單中需要備注相關(guān)信息，并提前郵件通知 Hi-C 相關(guān) 注意事項(xiàng)；特殊物種需要書面告知材料培養(yǎng)條件（光、溫度、水、肥 or 有機(jī)營養(yǎng)物等等）
6)生長狀態(tài)趨于不好的樣品，或一些離體枝條需要提前與實(shí)驗(yàn)溝通，保證到樣后可及時(shí)處理 樣品
1.5法定節(jié)假日期間和周末送樣要求
1)節(jié)假日當(dāng)天及假日前后各一周不建議再到樣， 如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實(shí)驗(yàn)平臺(tái)溝通送樣需求
2)周末休息日2 天不建議到樣，如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實(shí)驗(yàn)平臺(tái)溝通送樣需求
2、動(dòng)物樣本-全血
2.1新鮮血液
血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后立即送樣，并盡量確 保 24h 內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室
2.2凍存血液
血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后直接液氮速凍，干冰 運(yùn)輸
2.3血液需求量
每一個(gè)樣品，建議送樣 1~2 mL
2.4全血取樣注意事項(xiàng)（防止污染、溶血）
1)取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液 樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染
2)準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）
3)依據(jù)抗凝管的實(shí)際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL 規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL
4) 取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻
5)天氣較熱時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)使用冰袋低溫運(yùn)輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)無需加冰袋 運(yùn)輸
3、動(dòng)物樣本-組織標(biāo)本
3.1凍存樣品取樣要求
1)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時(shí)間不要太長（以凍存時(shí)間 1 個(gè)月為宜）
2)應(yīng)將肌肉表面附著的血液、脂肪、毛皮等非肌肉組織處理干凈
3)直接液氮速凍干冰運(yùn)輸
3.2凍存組織樣品理論用量
組織量 2 g 為佳，最少 1 g；1 g 可滿足 3 個(gè)文庫構(gòu)建，最低要求至少 0.2 g
4、動(dòng)物樣本-細(xì)胞
4.1取樣要求
需要進(jìn)行甲醛交聯(lián)固定后送樣
4.2細(xì)胞樣品量要求
一般來講 2*10^6個(gè)細(xì)胞滿足一個(gè) Hi-C 文庫，建議培養(yǎng)到 107 個(gè)細(xì)胞用于固定，以保證 試驗(yàn)的可重復(fù)性， 由于細(xì)胞的數(shù)量可能會(huì)影響 Hi-C 試驗(yàn)的質(zhì)量，因此需要細(xì)胞數(shù)目盡量精確
4.3交聯(lián)細(xì)胞
1) 取 10^7 個(gè)新鮮活細(xì)胞置于 15 mL 離心管中，加入 10 mL 的 cold 1×PBS 搖勻，1000 g， 4℃離心 2 min
2)吸棄上清，每管再次加入 10 mL 的 cold 1×PBS 輕混勻，1000g ，4℃離心 2 min
3)吸棄上清，用 10 mL cold 1 × PBS 重懸沉淀，加入適量（570 μL）37%甲醛（終濃度 2%）混勻，室溫放置 10 min(1-2 min 混勻一次)；（注意甲醛需要使用 sigma 等進(jìn)口品 牌，以免影響固定效果，也可以由當(dāng)?shù)劁N售申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)室寄送固定試劑）
4)加適量（710 μL）2 M 的甘氨酸（常溫保存）終止反應(yīng)（終濃度 0.125 M），室溫混勻5min，冰上放置15min
5)固定好的細(xì)胞 600 g 4℃ 離心 8 min ，棄上清
6)1 mL cold PBS 重懸沉淀，600g 4℃ 離心 8 min ，去上清
7)液氮速凍干冰運(yùn)輸或-80℃保存
注：做到此步直接液氮速凍，干冰運(yùn)輸，信息單中備注：“細(xì)胞交聯(lián)完成”
5、真菌樣本
5.1凍存樣品—“慢凍快融”或“直接速凍 ”
1) 應(yīng)保證菌體為對(duì)數(shù)生長期，保存時(shí)間不要太長（以凍存時(shí)間 1 個(gè)月為宜）
2)直接液氮速凍干冰運(yùn)輸
5.2組織樣品理論用量
組織量 1 g 為佳，最少 0.2 g
6、植物樣本
6.1活體植株
1)幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗、組培苗——全部葉片、部分幼嫩莖
2)成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2 片幼嫩葉片
3)取樣量：保證每一個(gè)庫的理論用量 1g
4)其它：特殊貴重活體樣品需要客戶提供樣品的種植、保存條件，以保證樣品的正常生長
6.2離體枝條
1)枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉（到樣后會(huì)選擇葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）；枝條中下端保留部分成熟葉片
2)枝條預(yù)處理：剪斷枝條， 自底端往上約 5 cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋， 袋中 噴水，填充部分空氣，密封袋口
3)枝條運(yùn)輸： 自封袋放入泡沫箱，箱體內(nèi)側(cè)壁放部分冰袋（保證低溫運(yùn)輸），冰袋與自封袋 間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導(dǎo)致樣品被凍傷
4)運(yùn)輸時(shí)間：保證 24h內(nèi)到樣，最多不得超過 3天
5)取樣量：保證每一個(gè)庫的理論用量1g
6)其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項(xiàng)目，如野外采樣、植株過大等導(dǎo)致的取樣或運(yùn)輸比較困難的項(xiàng)目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實(shí)驗(yàn)；離體枝條如果保存、運(yùn)輸不善會(huì)存在部分潛在風(fēng)險(xiǎn)：即得到的實(shí)驗(yàn)效果可能會(huì)比活體植株檢測(cè)結(jié)果 稍差（理論上的潛在風(fēng)險(xiǎn)）
6.3凍存植物組織
6.3.1凍存組織風(fēng)險(xiǎn)
1)植物組織液氮速凍后容易造成破碎，導(dǎo)致后續(xù)固定等操作無法有效實(shí)施
2)植物組織破碎嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)核甚至染色體造成物理機(jī)械損傷
6.3.2取樣要求
1)從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干
2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片
3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于 2mL或更大體積的旋蓋凍存管中，每份植物> 1 g，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱
4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存
5)為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣品備份 1-2 份，植物> 1 g/份，以防部分樣品降解重新取材、制備或送樣
6)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時(shí)間不要太長（以凍存時(shí)間 1 個(gè)月為宜）
7)運(yùn)送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸
6.4其他植物樣本
1)非葉片（活體植株）：有常規(guī)提取經(jīng)驗(yàn)，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位
2)非葉片（離體植株）：處理與運(yùn)輸與離體枝條相同，有常規(guī)提取經(jīng)驗(yàn)，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位
3)取樣量：保證每一個(gè)庫的理論用量 1 g
4)非葉片樣品適用于葉片難提取的植株或老師的特殊要求，此類樣品DNA提取失敗的風(fēng)險(xiǎn)高于葉片樣本，需要銷售與老師交代清楚
6.5植物取樣注意事項(xiàng)
1)建議一次送樣量在 1~4g
2)所有待取的幼嫩組織長勢(shì)必須正常（無病蟲害、無營養(yǎng)缺失）
3)對(duì)于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時(shí)不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第1-2 片嫩葉
4)因?yàn)橥ǔＢ阕又参锉缺蛔又参锔y選擇適合的解離液，裸子植物的葉子大多為針形、 線形、鱗形，葉片表面有較厚的角質(zhì)層，細(xì)胞內(nèi)次生代謝物多，這對(duì)提取完整的細(xì)胞核極為不利，因此，選取
萌發(fā)的新鮮幼苗作為材料會(huì)更合適
5)客戶沒有條件寄送活體植物樣本時(shí)，可以選擇自己固定，由當(dāng)?shù)劁N售像實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)寄送固定試劑 ( β-巰基乙醇需要老師自己準(zhǔn)備）
7、Hi-C交聯(lián)流程
1)配制NIBuffer工作液 1 ，配制好后置于冰上放置
2)取2g新鮮幼嫩組織樣品，用冰水清洗干凈
3)用剪刀將樣品組織剪碎，放置于50mL 離心管中
4)加入上述配制好的NIBuffer 工作液1
5)加入 2 mL 36%甲醛溶液，室溫條件下，旋轉(zhuǎn)雜交爐中反應(yīng) 90 min
6)加入2.5 mL 2M甘氨酸，連續(xù)手搖 5 min終止交聯(lián)反應(yīng)
7)濾掉液體，用滅菌水清洗至無泡沫為止
8)吸干樣品表面水分，將樣品置于預(yù)冷的50ml離心管中，并將管置于液氮中
9)-80℃保存或干冰寄送
二、百邁客 ATAC-seq 取樣要求
1、生物學(xué)重復(fù)
取樣應(yīng)盡量減少重復(fù)間樣品的差異。盡可能做到重復(fù)在取樣時(shí)間、部位、處理?xiàng)l件等方 面保持一致，不同樣本的性別、年齡盡量相同，否則可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性及可信度
每個(gè)處理至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)
2、樣品的保存與運(yùn)輸
簡單處理并標(biāo)記后，應(yīng)立即浸入液氮中速凍，之后保存于-80℃冰箱，以免實(shí)驗(yàn)操作前 樣品降解的可能性
3、取樣要求
3.1組織樣本
1)獲取組織樣本
A.動(dòng)物：取下新鮮的組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪等雜質(zhì)部分，用預(yù)冷的 1×PBS 溶液漂洗，將組織表面的殘留血液沖洗干凈
B.植物：從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干
2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片
3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中 ，每份組 織>50mg ，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱
4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存
5)為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣品備份 1-2 份，組織>50mg/份，以防部分樣品降解重新取材、 制備或送樣
6)運(yùn)送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸
7)注意事項(xiàng)
A.昆蟲類樣本建議進(jìn)行饑餓處理后送樣
B.若樣本有微生物污染（細(xì)菌、病毒等），實(shí)驗(yàn)過程無法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會(huì)有污染
3.2細(xì)胞樣本
3.2.1貼壁細(xì)胞
3.2.2懸浮細(xì)胞
1)細(xì)胞獲取
A.將貼壁細(xì)胞用移液器緩慢地吹/刮至懸浮狀，或采用胰酶或 EDTA 消化方法制備細(xì)胞懸液
B.確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好
2)按照 50萬個(gè)細(xì)胞每管進(jìn)行分裝，準(zhǔn)確標(biāo)記后將分裝好的細(xì)胞 4℃、500G 離心 5min。（到公司后解凍， 由我們?cè)偬暨x 5萬個(gè)相對(duì)完整的細(xì)胞核進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）
3)小心吸去全部上清，加入 500 μL 預(yù)冷的 1×PBS 溶液洗滌，4℃ 、500G 離心 5min
4)小心吸去全部液體，加入 1 mL 預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，寬口槍頭輕輕吹打細(xì)胞沉淀混勻， 管壁標(biāo)記樣本名稱，慢速梯度降溫凍存
5)梯度降溫可參考：4 度 10min＞負(fù) 20 度 30min＞負(fù) 80 度過夜＞液氮凍存
6)將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入足量的干冰 進(jìn)行運(yùn)輸
7)為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣品備份 1-2 份，50萬個(gè)/份，以防部分樣品降解重新取材，制備或送樣
注：若細(xì)胞樣本有支原體污染，實(shí)驗(yàn)過程無法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會(huì)有污染
3.3全血樣本
1)新鮮血液：每一個(gè)樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝 素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，確保
5天內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室
2)凍存血液：每一個(gè)樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，平衡
2 h 后直接液氮速凍，干冰運(yùn)輸
3)注意事項(xiàng)
A.取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染
B.準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）
C.依據(jù)抗凝管的實(shí)際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL
D.取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻
E.天氣較熱時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)使用冰袋低溫運(yùn)輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)無需加冰袋運(yùn)輸
]]>規(guī)格
| 組份 | 規(guī)格 |
| 組織固定液 | 8.75ml(開封后需添加?26.25ml?無水乙醇） |
| Buffer?Ⅰ | 20ml（開封后需添加?20ml?無水乙醇） |
| 組織透明液 | 35ml |
| BufferⅡ | 40ml |
| 石蠟 | 35ml |
| 操作手冊(cè) | 1?份 |
保存方法
試劑盒常溫運(yùn)輸，常溫保存，有效時(shí)間截止開封后 60 天。
產(chǎn)品介紹
植物石蠟包埋試劑盒，是一種在保留 RNA 完整性的同時(shí)又可進(jìn)行石蠟包埋獲得結(jié)構(gòu)完整性 更好的植物切片的試劑盒。目前常用的植物切片方法主要有徒手切片法、石蠟切片法、冷凍 切片法。徒手切片需要新鮮組織，即取即用無法長時(shí)間不存組織；冷凍切片法對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu) 大含水量較多的組織無法保證組織結(jié)構(gòu)的完整性；常規(guī)石蠟切片法無法保證組織 RNA 完整 性，無法適用于需要長期保存且對(duì) RNA 有要求的試驗(yàn)。本試劑盒通過低溫短時(shí)間固定透明， 并采用特定包埋石蠟可在包埋時(shí)有效降低了組織 RNA 降解。
適用組織類型
幼莖、主根（木質(zhì)化程度低）；莖尖分生組織、花芽；生長期籽粒（淀粉含量低）、胚珠、 花苞、葉片
需要而未提供的材料
Tween20、無水乙醇、超純水、移液器、離心管、吸頭、0.22um 針頭式過濾器、真空濃縮儀、 恒溫箱、包埋盒
操作步驟
1 、開始前將組織固定液（確定已添加無水乙醇）吸取 4ml 于 5ml 離心管，放置 4℃預(yù)冷
2 、樣品準(zhǔn)備：用超純水徹底清洗組織表面所有雜質(zhì)，去除目標(biāo)區(qū)域組織周圍其余組織并將組織修整為 適合包埋大小。（為了石蠟更好滲透組織一般組織取材長度不超過 8mm，厚度不超過 5mm， 直徑不超過 1cm；若樣本內(nèi)部有空腔需盡可能暴露空腔，例：包埋花苞樣本時(shí)裁去花苞頂端 閉合的花瓣暴露空腔方便石蠟進(jìn)入)
3 、配置 10ml 0.05%Tween 20 ，并進(jìn)行預(yù)冷
4 、將修整好的組織放入 0.05%Tween20 中，室溫孵育 15min。
5 、取出孵育后的組織，將組織表面的試劑用無塵紙沾干。
6 、將組織放入預(yù)冷的組織固定液中，顛倒混勻，使組織完全浸沒并平放于 4℃過夜固定， 固定時(shí)間為 15-18h ，固定液體積需要超出組織體積的兩倍。同時(shí)將石蠟放置于 38.5℃恒溫 箱進(jìn)行溶解。
7 、吸取 4ml Buffer Ⅰ（確定已添加無水乙醇）置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出固定后的組織，用無 塵紙吸取組織表面多余液體，放入預(yù)冷好的過渡液 1 中，冰上孵育 1h 。同時(shí)將 BufferⅡ至于 38.5℃恒溫箱中溶解。
8 、吸取 4ml 組織透明液置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出孵育后的組織，用無塵紙吸取組織表面多 余液體，放入預(yù)冷好的組織透明液中，冰上孵育 1.5h。
*注意：組織在孵育試劑轉(zhuǎn)換的過程中需快速進(jìn)行，以免組織表面試劑揮發(fā)造成組織表面出現(xiàn)皺縮或風(fēng)干
9 、BufferⅡ顛倒混勻后，取 1.2ml 置于 1.5ml 離心管中，取出孵育后的組織，用無塵紙吸取組織表面多余液體后將組織放入 BufferⅡ中，將離心管開蓋放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空1.5h。
*注意：若組織放入 BufferⅡ后 ，試劑出現(xiàn)凝固可置于恒溫箱中溶解后再進(jìn)行抽真空操作， 真空濃縮儀溫度 42℃ , 壓力小于 40KPa ，轉(zhuǎn)速 1300-1500rpm。
10 、將溶解好的石蠟顛倒混勻，取出離心后的組織，將組織放置于盛有 1.2ml 石蠟的 1.5ml 離心管中，之后將其放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空 2h ，間隔 1h 跟換一次新石蠟。
11 、抽真空結(jié)束后取出組織，將石蠟加入包埋盒，并將組織按照切片方向放置，調(diào)整好后放 置于冰上凝固冷凍。
*注意：多個(gè)組織需將組織放置于同一平面，且組織需處于包埋盒中間位置，組織任何邊緣不能靠近包埋盒邊緣 ，以免切片組織破碎。
12 、將已凝固的包埋塊小心放于-20℃ , 冷凍 2h。
13 、將已凝固的包埋塊用錫紙包裹小心保存于-80℃ , 避免劇烈磕碰，劇烈磕碰易導(dǎo)致石蠟 塊出現(xiàn)裂縫。
*注意：從-20 轉(zhuǎn)到-80 或者干冰的時(shí)候，包埋盒的底部一定不要接觸到干冰或者冰箱底面。可將包埋盒架起 ，讓其緩慢冷卻 ，快速冷凍石蠟可能會(huì)產(chǎn)生裂紋
常見問題分析
1 、固定后組織變色或者部分變色
可能原因：組織固定液造成的組織脫色，不影響后續(xù)包埋可繼續(xù)包埋流程。
2 、石蠟溶解后出現(xiàn)白色團(tuán)塊或未能完全溶解
建議措施： ①升高溶解溫度，待完全溶解后在 38.5℃恒溫。
3 、浸蠟后組織靠中心結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)白色，組織邊緣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)透明 可能原因：組織浸蠟不完全
建議措施：加長浸蠟時(shí)間，但不可加長超過 1h ，浸蠟時(shí)間影響組織 RNA 完整性。
]]>1.1植物組織：CTAB法
1)液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2)向離心管中加入 CTAB，水浴
3)離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4)向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5)加入 75％乙醇，離心，棄上清
6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱
1.2動(dòng)物組織：SDS法
1)液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2)加入 SDS 溶液，水浴
3)加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4)向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5)向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6)加入 75％乙醇，離心，棄上清
7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱
1.3動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法
QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101
1.4粗體核酸純化
試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223
試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243
1.5微生物樣本
使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取
2、檢測(cè)方法
2.1檢測(cè)方法
1)濃度檢測(cè)
Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000
Qubit：invitrogen ，型號(hào)QubitTM3Flurometer
2)完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）
電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600
電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥2μg（單次建庫）
2)濃度≥50ng/ul
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280在1.7-2.2之間，OD260/230在1.7-2.5之間
5)AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無或有輕微污染，N/Q在0.9-2.0之間
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)
3、建庫方法
3.1建庫流程
1) 準(zhǔn)備高質(zhì)量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化
2)使用BluePippin進(jìn)行片段篩選
3)使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加 A
4)使用無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒添加 barcode 序列
5)使用無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒完成測(cè)序接頭的連接
3.2建庫試劑
1)文庫構(gòu)建試劑：NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號(hào) M6630L 廠家 NEB
2)文庫構(gòu)建試劑：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號(hào)E7546L 廠家NEB
3)文庫構(gòu)建試劑：無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒1-96 貨號(hào)SQK-NBD114.96 廠家Nanopore
3.3建庫設(shè)備
數(shù)字 3*32PCR 儀 廠家 Appliedbiosystems 儀器規(guī)格 proflex3*32
制冷型程控五段金屬浴 廠家 天根生化科技（北京）有限公司 儀器規(guī)格 OSE-DB-02
4、測(cè)序方法
4.1上機(jī)操作
1)用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
2)用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫
3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)
4.2測(cè)序試劑
測(cè)序芯片制備試劑盒 貨號(hào) EXP-FLP004 廠家 Nanopore
測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒 貨號(hào) EXP-AUX003 廠家 Naonopore
測(cè)序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 貨號(hào) FLO-PRO114M 廠家 Nanopore
4.3測(cè)序設(shè)備
PromethION48 測(cè)序儀 廠家 Nanopore 儀器規(guī)格 PromethION48
]]>1.1植物組織：CTAB法
1)液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2)向離心管中加入 CTAB，水浴
3)離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4)向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5)加入 75％乙醇，離心，棄上清
6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱
1.2動(dòng)物組織：SDS法
1)液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2)加入 SDS 溶液，水浴
3)加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4)向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5)向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6)加入 75％乙醇，離心，棄上清
7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱
1.3動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法
QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101
1.4粗體核酸純化
試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223
試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243
1.5微生物樣本
使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取
2、檢測(cè)方法
2.1檢測(cè)方法
1)濃度檢測(cè)
Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000
Qubit：invitrogen ，型號(hào)QubitTM3Flurometer
2)完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）
電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600
電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥6μg（單次建庫）
2)濃度≥50ng/ul
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280在1.7-2.2之間，OD260/230在1.7-2.5之間
5)AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無或有輕微污染，N/Q在0.9-2.0之間
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)
3、建庫方法
1) DNA 打斷
A.加入0.75-1.5 μg gDNA，補(bǔ)Elution Buffer 至100 μL，將gDNA樣品稀釋到終濃度為7.5 ng/μL -15 ng/μL。小心轉(zhuǎn)移到g-TUBE 管中，4600rpm離心2分鐘
B.重復(fù)離心，直至全部gDNA樣品通過g-TUBE孔洞
C.倒置g-TUBE管，離心2分鐘
D.收集打斷好的gDNA樣品于新的1.5 mL低吸附離心管中
2)PB純化
A.將gDNA樣品稀釋到100 μL，若體積超過100 μL，則不需要稀釋
B.向樣品中中加入 0.45*體積的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）
C.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
D.室溫放置30分鐘，瞬離1秒
E.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
F.使用1.5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
G.瞬離1s，將酒精棄凈
H.向管中加入20 μL 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
I.10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
J.吸取20 μL上清液于新的1.5 mL低吸附離心管中
K.取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定
3)DNA修復(fù)
A.向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑：
| 試劑 | 體積（μL） |
| Repair buffer | 8 |
| End repair Mix | 4 |
| DNA repair mix | 2 |
| 總體積（Reaction Mix 1） | 14 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.向每個(gè)樣品中加入14μL Reaction Mix 1
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
E.孵育
| 溫度 | 時(shí)間（min） |
| 37℃ | 30 |
| 65℃ | 5 |
| 4℃ | Hold |
4)接頭連接
A.向上述產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| SMRTbell adapter | 4 |
| Ligation mix | 30 |
| Ligation enhancer | 1 |
| 總體積（Reaction Mix 2） | 35 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.向每個(gè)樣品中加入35μL Reaction Mix 2
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1秒
E.孵育
| 溫度 | 時(shí)間（min） |
| 20℃ | 30 |
| 4℃ | Hold |
5)PB純化
A.向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30分鐘）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.室溫放置10分鐘，瞬離1秒
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫5分鐘溶解DNA，瞬離1秒
I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附離心管中
J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定
6)酶處理
A.向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| Nuclease buffer | 5 |
| Nuclease mix | 5 |
| 總體積（Reaction Mix 3） | 10 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.孵育
| 溫度 | 時(shí)間（min） |
| 37℃ | 15 |
| 4℃ | Hold |
7)PB磁珠片段篩選
A.向上述產(chǎn)物中加入3.1*體積的2.85*稀釋的AMPurePB磁珠（室溫平衡30分鐘）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1秒
C.室溫放置20分鐘，瞬離1秒
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用
E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫10-15分鐘溶解DNA，瞬離1秒
I.吸取上清液于新的1.5mL低吸附離心管中
J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復(fù)凍融
4、測(cè)序方法
1)最終文庫通過濃度（Qubit）及大?。ˋgilent 5400）的檢測(cè)，總量需要大于Smrtlink計(jì)算值。
2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對(duì)上機(jī)文庫進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
3)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序
5、實(shí)驗(yàn)用試劑
| 物料名稱 | 廠家 | 存貨代碼 | 規(guī)格 |
| g-TUBE | Covaris | g-TUBE | 10個(gè)/盒 |
| SMRTbell Prep Kit 3.0 | PACBIO | 102-182-700 | 24次/盒 |
| Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer | 英濰捷基 | Q32854 | 500次/盒 |
| AMPure PB (5ml)(純化磁珠) | PACBIO | 100-265-900 | 5ml/瓶 |
| SMRTbell cleanup Beads | PACBIO | 102-158-300 | 10000ul/瓶 |
| REVIO SPRQ POLYMERASE KIT | PACBIO | 103-496-900 | 24次/盒 |
| REVIO SPRQ SEQUENCING PLATE | PACBIO | 103-504-900 | 4次/盒 |
| REVIO SMRT CELL TRAY | PACBIO | 102-202-200 | 4張/盒 |
6、實(shí)驗(yàn)用設(shè)備
| 儀器名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 型號(hào) |
| 瞬時(shí)離心機(jī) | 天根生化科技（北京）有限公司 | OSE-MC8 |
| ﹣20℃度冰箱 | 青島海爾特種電冰柜有限公司 | BC/BD-629HK |
| 4°C 冰箱 | 海爾 | HYC-360 |
| 渦旋振蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC | vortex-2G560E |
| 基因擴(kuò)增儀 | Appliedbiosystems | veriti96well9902 |
| 恒溫金屬浴 | Eppendorf | ThermoMixer F1.5 |
| 磁力架 | 賽默飛世爾 | DynaMag96Side skirted |
| 測(cè)序儀 | Pacbio | Revio |
1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號(hào)：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒
3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號(hào)：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號(hào)：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2、檢測(cè)方法
2.1檢測(cè)方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號(hào) ：Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時(shí)若GX檢測(cè)6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3、建庫方法
3.1建庫流程
1) 全長cDNA的合成
A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Total RNA（1ug） | X |
| 3’ SMART?CDS Primer II A (12 μM) | 1 |
| Nuclease-Free Water | 3.5-X |
| Total Volume | 4.5 |
B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，置于PCR儀上
C.72℃ 3min，42℃ 2min，72℃到42℃降溫速率設(shè)置為 0.1℃/s
D.在上步反應(yīng)期間，配制如下Mix
| Reagent | Volume（μL） |
| 5X First-Strand Buffer | 2 |
| DTT (100 mM) | 0.25 |
| dNTP Mix (10 mM ) | 1 |
| SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM) | 1 |
| RNase Inhibitor | 0.25 |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) | 1 |
| Total volume added per reaction | 5.5 |
E.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，42℃預(yù)熱1min后立即進(jìn)行下步反應(yīng)
F.取5.5μL預(yù)熱的Master Mix加入上步反應(yīng)完成的PCR管中；輕彈混勻，瞬時(shí)離心
G.42℃ 90min，70℃ 10min
H.向上述反應(yīng)完成的cDNA產(chǎn)物中加入70 μL Elution Buffer（試劑盒自帶，后邊簡稱EB）進(jìn)行稀釋（總體積80μL）
2)PCR擴(kuò)增
A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Diluted first-strand cDNA | 80 |
| 5’ PCR Primer II A (12 μM) | 8 |
| 5X PrimeSTAR GXL buffe (5X) | 80 |
| dNTP Mix (2.5 mM each) | 32 |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25 U/μL） | 8 |
| Nuclease-free water | 192 |
| Total Volume | 400 |
| Reagent | Volume（μL） |
B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，將Mix平均分到0.2mL PCR管中（每管50μL）
C.將PCR管置于PCR儀上，按照PCR條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增
| 98℃ | 30s | |
| 98℃ | 10s | 12cycles |
| 65℃ | 15s | |
| 68℃ | 10min | |
| 98℃ | 5min |
3)PCR純化
A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中
B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.5X（25μL）體積的AMPure?XP磁珠，充分混勻，瞬時(shí)離心
C.置于四維旋轉(zhuǎn)儀上混勻結(jié)合15 min
D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加入1.5mL的新配置的80%乙醇，靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.棄盡上清，室溫干燥30 s
H.向兩個(gè)1.5mL離心管分別加入22μL的Elution Buffer，輕彈混勻，置于四維旋轉(zhuǎn)儀上5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管
J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量
4)DNA修復(fù)
A. 向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| Repair buffer | 8 |
| End repair Mix | 4 |
| DNA repair mix | 2 |
| 總體積（Reaction Mix 1） | 14 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.向每個(gè)樣品中加入14μL Reaction Mix 1
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s
E.孵育
| 溫度 | 時(shí)間（min） |
| 37℃ | 30 |
| 65℃ | 5 |
| 4℃ | Hold |
5)接頭連接
A.向上述產(chǎn)物中加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| SMRTbell adapter | 4 |
| Ligation mix | 30 |
| Ligation enhancer | 1 |
| 總體積（Reaction Mix 2） | 35 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.向每個(gè)樣品中加入35μL Reaction Mix 2
D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s
E.孵育
| 溫度 | 時(shí)間（min） |
| 20℃ | 30 |
| 4℃ | Hold |
6)PB純化
A.向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30min）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.室溫放置10min，瞬離1s
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用
E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫5min溶解DNA，瞬離1s
I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附離心管中
J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定
4、測(cè)序方法
1)使用Sequel II Binding kit 2.1（Pacbio，USA） 對(duì)上機(jī)文庫進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
2)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行AMPure PB（Pacbio，USA）純化后置于SequelII（Pacbio，USA）測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序
5、實(shí)驗(yàn)試劑
| 物料名稱 | 廠家 | 貨號(hào) |
| SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit | TAKARA | 634925 |
| Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer | 英濰捷基 | Q32854 |
| Agencourt? AMPure? XP | Beckman | A63882 |
| SMRTbell Prep Kit 3.0 | PACBIO | 102-182-700 |
| SMRTbell cleanup Beads | PACBIO | 102-158-300 |
| AMPure PB | PACBIO | 102-182-500 |
| Sequel II Binding kit 2.1 | PACBIO | 101-626-600 |
| Sequel II Sequencing 2.0 Bundle (5 pack of 4 rxn plates) | PACBIO | 101-849-000 |
| SMRT Cell 8M | PACBIO | 101-389-001 |
6、實(shí)驗(yàn)設(shè)備
| 儀器名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 型號(hào) |
| 瞬時(shí)離心機(jī) | 天根生化科技（北京）有限公司 | OSE-MC8 |
| ﹣20℃度冰箱 | 青島海爾特種電冰柜有限公司 | BC/BD-629HK |
| 4°C 冰箱 | 海爾 | HYC-360 |
| 渦旋振蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC | vortex-2G560E |
| 基因擴(kuò)增儀 | Appliedbiosystems | veriti96well9902 |
| 恒溫金屬浴 | Eppendorf | ThermoMixer F1.5 |
| 磁力架 | 賽默飛世爾 | DynaMag96Side skirted |
| 測(cè)序儀 | Pacbio | SequelII |
1、提取方法
1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號(hào)：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒
3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號(hào)：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號(hào)：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2、檢測(cè)方法
2.1檢測(cè)方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號(hào) ：Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時(shí)若GX檢測(cè)6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3、建庫方法
3.1建庫流程
1) 全長cDNA的合成
A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Total RNA | X |
| Is-Seq RT Primer mix | 2 |
| Nuclease-free Water | 7-X |
| Total Volume | 9 |
B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，置于PCR儀上
C.70℃反應(yīng) 5 min ，20℃ hold（80℃熱蓋），立即進(jìn)行下步反應(yīng)
D.在上步反應(yīng)期間，配制如下Mix
| Reagent | Volume（μL） |
| Iso-Seq RT buffer | 5 |
| Iso-Seq RT enzyme mix | 2 |
| Nuclease-free Water | 3 |
| Total Volume | 10 |
E.輕彈混勻，瞬時(shí)離心
F.取 cDNA 反應(yīng)產(chǎn)物 9 μL 中加入 10 μL 上述 Mix
G.輕彈混勻，瞬時(shí)離心
H.42℃反應(yīng) 45 min ，20℃ hold（52℃熱蓋），立即進(jìn)行下步反應(yīng)
I.向反應(yīng)完的產(chǎn)物中加入 2 μL Iso-Seq template switch oligo ，總體積達(dá)到 21 μL
J.輕彈混勻，瞬時(shí)離心
K.42℃反應(yīng) 15 min ，4℃ hold（52℃熱蓋）
2)磁珠純化
A.將上步反應(yīng)產(chǎn)物（21μL），移入新的1.5mL低吸離心管中，加入29μLElutionBuffer
B.向1.5mL離心管中加入1.3×（65μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻
C.室溫孵育10min
D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.瞬時(shí)離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管中加入21μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管
3)cDNA擴(kuò)增
A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑
Reagent Volume（μL）
| Reagent | Volume（μL） |
| Iso-Seq cDNA PCR mix | 25 |
| Iso-Seq cDNA amplification prime | 2 |
| Total Volume | 27 |
B.向純化產(chǎn)物中加入27μl上述mix
C.加入2μlIso-SeqprimerBarcode，總體積達(dá)到50μl
D.充分輕彈混勻，瞬時(shí)離心
E.按照下面反應(yīng)程序反應(yīng)
| 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
| 98℃ | 45s | 1 |
| 98℃ | 10s | 12 |
| 60℃ | 15s | |
| 72℃ | 3min | |
| 72℃ | 5min | 1 |
| 4℃ | Hold | 1 |
4)磁珠純化
A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中
B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.9X（45μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時(shí)離心
C.室溫孵育10min
D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加入200μl新配置的80%乙醇，靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管
J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總
5)混樣
A.根據(jù) Qubit 檢測(cè)結(jié)果、數(shù)據(jù)需求量進(jìn)行混樣，混樣總量達(dá)到 55ng ，置于冰上
B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心
6)kinnex PCR
A.分別加入以下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Nuclease-free Water | 88-X |
| Kinnex PCR mix | 110 |
| 55 ng cDNA | X |
| Total Volume | 198 |
B.分 22.5 μL 的 Mix 產(chǎn)物加入到 8 連排管中
C.每管中加入2.5μL Kinnex primer mix A-HQ
D.輕彈混勻，瞬時(shí)離心
E.按照下面反應(yīng)程序反應(yīng)
| 溫度 | 時(shí)間 | 循環(huán)數(shù) |
| 98℃ | 3min | 1 |
| 98℃ | 20s | 9 |
| 68℃ | 30s | |
| 72℃ | 4min | |
| 72℃ | 5min | 1 |
| 4℃ | Hold | 1 |
7)磁珠純化
A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中，總體積184μL
B.向1.5mL離心管中加入1.05X（193μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時(shí)離心
C.室溫孵育10min
D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加入200μl的新配置的80%乙醇，靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管
J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量
8)串聯(lián)
A.分別加入以下試劑
| Reagent | Volume（μL） |
| Nuclease-free Water | 39-X |
| 純化產(chǎn)物 5 μg | X |
| Kinnex adapter bc | 2 |
| Total | 41 |
B.配置以下mix
| Reagent | Volume（μL） |
| Kinnex array and repair buffer | 7 |
| Kinnex enzyme | 4 |
| Kinnex ligase | 6 |
| Total | 17 |
C.向41μL反應(yīng)產(chǎn)物中加入17μL的mix，輕彈混勻，瞬時(shí)離心
D.45℃反應(yīng)60min，4℃hold（52℃熱蓋）
E.加入2μLDNArepairmix，輕彈混勻，瞬時(shí)離心
F.45℃反應(yīng)30min，4℃hold（60℃熱蓋）
9)磁珠純化
A.將上步反應(yīng)產(chǎn)物移入新的1.5mL低吸離心管中，總體積60μL
B.向1.5mL離心管中加入1×（60μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻
C.室溫孵育10min
D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）
E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s
F.棄上清，重復(fù)漂洗一次
G.瞬時(shí)離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min
H.向離心管中加入40μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min
I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管
J.使用Qubit檢測(cè)濃度
10)酶處理
A.向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑
| 試劑 | 體積（μL） |
| Nuclease buffer | 5 |
| Nuclease mix | 5 |
| 總體積（Reaction Mix 3） | 10 |
B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.孵育
| 溫度 | 時(shí)間（min） |
| 37℃ | 15 |
| 4℃ | Hold |
11)PB磁珠片段篩選
A.向上述產(chǎn)物中加入3.1*體積的 2.85*稀釋的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）
B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s
C.室溫放置20min，瞬離1s
D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用
E.使用1.5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次
F.瞬離1s，將酒精棄凈
G.向管中加入 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻
H.室溫10-15min溶解DNA，瞬離1s
I.吸取上清液于新的1.5 mL低吸附離心管中
J.取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復(fù)凍融
4、測(cè)序方法
1)最終文庫通過濃度（Qubit）檢測(cè)，總量需要大于Smrtlink
2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對(duì)上機(jī)文庫進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
3)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序
5、實(shí)驗(yàn)試劑
| 物料名稱 | 廠家 | 貨號(hào) |
| SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit | TAKARA | 634925 |
| Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer | 英濰捷基 | Q32854 |
| Agencourt? AMPure? XP | Beckman | A63882 |
| SMRTbell Prep Kit 3.0 | PACBIO | 102-182-700 |
| SMRTbell cleanup Beads | PACBIO | 102-158-300 |
| AMPure PB | PACBIO | 102-182-500 |
| REVIO SPRQ POLYMERASE KIT | PACBIO | 103-496-900 |
| REVIO SPRQ SEQUENCING PLATE | PACBIO | 103-504-900 |
| REVIO SMRT CELL TRAY | PACBIO | 102-202-200 |
6、實(shí)驗(yàn)設(shè)備
| 儀器名稱 | 生產(chǎn)廠家 | 型號(hào) |
| 瞬時(shí)離心機(jī) | 天根生化科技（北京）有限公司 | OSE-MC8 |
| ﹣20℃度冰箱 | 青島海爾特種電冰柜有限公司 | BC/BD-629HK |
| 4°C 冰箱 | 海爾 | HYC-360 |
| 渦旋振蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC | vortex-2G560E |
| 基因擴(kuò)增儀 | Appliedbiosystems | veriti96well9902 |
| 恒溫金屬浴 | Eppendorf | ThermoMixer F1.5 |
| 磁力架 | 賽默飛世爾 | DynaMag96Side skirted |
| 測(cè)序儀 | Pacbio | Revio |
1、提取方法
1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號(hào)：DP441）
2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒
3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol
4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號(hào)：217004）
5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號(hào)：2145A）試劑盒
6)EDTA抗凝血：TRIzol
2、檢測(cè)方法
2.1檢測(cè)方法
使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號(hào) ：Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)
2.2判定標(biāo)準(zhǔn)
1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫
2)濃度≥20（ng/ul）
3)體積≥10(ul)
4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常
5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時(shí)若GX檢測(cè)6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬
6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格
3、建庫方法
3.1建庫流程
1) 利用帶OligodT的反轉(zhuǎn)錄引物通過退火與mRNA的polyA尾結(jié)合，然后加入RT逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈
2)使用含barcode的擴(kuò)增引物擴(kuò)增成雙鏈cDNA，并為樣品加上barcode
3)使用NEB Next FFPE DNA Repair Mix和NEB Next Ultra II End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加A
4)使用SQK-LSK114試劑盒完成測(cè)序接頭的連接
3.2建庫設(shè)備
數(shù)字 3*32PCR 儀 廠家 Appliedbiosystems 儀器規(guī)格 proflex3*32
制冷型程控五段金屬浴 廠家 天根生化 儀器規(guī)格 OSE-DB-02
3.3建庫試劑盒
1)PCR條形碼試劑盒 貨號(hào) EXP-PBC096 廠家 Nanopore
2)NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號(hào) M6630L 廠家 NEB
3)NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號(hào) E7546L 廠家 NEB
4)連接測(cè)序試劑盒 V14 貨號(hào) SQK-LSK114 廠家 Nanopre
4、測(cè)序方法
4.1上機(jī)操作
1)用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
2)用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫
3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)
4.2測(cè)序設(shè)備
PromethION48 測(cè)序儀 廠家 Nanopore 儀器規(guī)格 PromethION48
4.3測(cè)序試劑
測(cè)序芯片制備試劑盒 廠家 Nanopore 貨號(hào) EXP-FLP004
測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒 廠家 Naonopore 貨號(hào) EXP-AUX003
測(cè)序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 廠家 Nanopore 貨號(hào) FLO-PRO114M
]]>