英文名:?Integration of full-length transcriptomics and?targeted metabolomics to identify?benzylisoquinoline alkaloid biosynthetic genes in?Corydalis yanhusuo

雜志：Horticulture Research

影響因子：5.404

研究背景

延胡索( Corydalis yanhusuo W.T. Wang) ，別名元胡，罌粟科紫堇屬多年生草本植物，常以其干燥塊莖入藥，是世界上具有低成癮性和耐受性的鎮(zhèn)痛中藥，鎮(zhèn)痛效價(jià)約為嗎啡的60%。四氫巴馬汀和左旋紫堇達(dá)明已被確認(rèn)為延胡索中具有鎮(zhèn)痛活性成分，可作為阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥的替代品，但含量低下，產(chǎn)量較小的缺點(diǎn)制約著該類(lèi)藥物的應(yīng)用。

研究目的

對(duì)合成原小檗堿型芐基異喹啉生物堿的相關(guān)基因進(jìn)行了挖掘，為后期利用合成生物學(xué)與植物代謝工程生產(chǎn)延胡索中具有鎮(zhèn)痛效果的痕量化合物奠定了基礎(chǔ)。

材料方法

延胡索，成熟期的葉和塊莖，道地產(chǎn)區(qū)浙江磐安

代謝：UPLC-Q-TOFMS定性定量

轉(zhuǎn)錄組：二代+三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

研究結(jié)果

1、轉(zhuǎn)錄組和代謝組測(cè)序分析

該研究以來(lái)自道地產(chǎn)區(qū)浙江磐安的延胡索成熟期的葉和塊莖為研究對(duì)象，采用UPLC-Q-TOFMS定性定量分析了延胡索中具有鎮(zhèn)痛活性的成分，并通過(guò)二代校準(zhǔn)的三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法對(duì)合成原小檗堿型芐基異喹啉生物堿的相關(guān)基因進(jìn)行了挖掘。

延胡索提取物的塊莖和葉組QTOF-MS數(shù)據(jù)的代謝組學(xué)多元分析

延胡索塊莖和葉片之間基因的差異表達(dá)

2.、轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析

對(duì)處于不同器官的組織樣品進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析，最終鑒定到了101個(gè)參與芐基異喹啉生物堿(benzylisoquinoline alkaloid,BIA)生物合成途徑的unigenes和38種在延胡索葉與塊莖中含量具有顯著差異的代謝物，并對(duì)其中19種典型的代謝物進(jìn)行了器官差異性豐度測(cè)定。結(jié)果顯示，目前已知的合成途徑在延胡索中報(bào)導(dǎo)過(guò)的BIAs合成途徑中均成功對(duì)應(yīng)到至少一種關(guān)鍵合成酶的unigene，說(shuō)明BIA的空間分布差異主要受到轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。

芐基異喹啉生物合成途徑

3、 OMT蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其中參與合成具有廣泛臨床鎮(zhèn)痛潛力的關(guān)鍵代謝物四氫巴馬汀的酶可能與唯一已知的黃連中負(fù)責(zé)催化這一步反應(yīng)的ColumbamineO-methyltransferase(CoOMT)存在較大的蛋白質(zhì)序列差異。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析，作者們推斷出至少存在10種unigenes的翻譯產(chǎn)物可能催化四氫巴馬汀的合成。 特異性的氧甲基化是四氫巴馬汀與紫堇達(dá)明合成的關(guān)鍵，延胡索中是否存在特殊的一類(lèi)OMT或者具有不同底物特異性的OMT則是接下來(lái)將要重點(diǎn)解析的重點(diǎn)。

OMT蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

文章亮點(diǎn)

本研究明確了鎮(zhèn)痛成分的生物合成機(jī)制，同時(shí)為進(jìn)一步生化水平上的活性驗(yàn)證提供了方向，且為后期延胡索功能基因組的解析奠定基礎(chǔ)。

?

食品是非常復(fù)雜的基質(zhì)，含有數(shù)千種成分，是動(dòng)植物代謝的結(jié)果。食品成分在加工前、加工過(guò)程中和加工后都受到外部因素的影響。食品品質(zhì)已成為肉品行業(yè)的主要關(guān)注點(diǎn)之前。對(duì)質(zhì)量的評(píng)估包括香氣、風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和色澤等多個(gè)方面，需要通過(guò)不同的方法來(lái)進(jìn)行評(píng)估，使得方法及其復(fù)雜。而基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法信息豐富，可以獲取代謝物的信息，將其特性和食品品質(zhì)關(guān)聯(lián)一起，為解決這復(fù)雜問(wèn)題提供了支撐。

01、輻照對(duì)絞肉代謝組學(xué)特征的影響及其對(duì)食品安全的影響

輻照是一種高效滅菌方法，對(duì)肉類(lèi)保存具有重要作用。本研究基于定性非靶向?HPLC-Orbitrap?代謝組學(xué)方法，旨在估計(jì)輻照雞肉、火雞和混合（雞肉、火雞和豬肉）絞肉的全局代謝組譜變化，以評(píng)估可能存在的食品安全關(guān)于代謝組改變的問(wèn)題。通過(guò)LC-MS共鑒定了?402?種代謝物，并且所有三種基質(zhì)都表現(xiàn)出特定的代謝組譜，該譜組不受應(yīng)用五種不同輻照強(qiáng)度水平的顯著影響。特別是，所有三個(gè)肉類(lèi)類(lèi)別都顯示出以下共同特征：

1)?游離氨基酸庫(kù)不受輻射影響

2)??；撬崴坪跏撬腥?lèi)*重要的區(qū)別因素

3)?谷胱甘肽的含量減少

4)?發(fā)生輕微的多不飽和游離脂肪酸的氧化修飾

5)?強(qiáng)化的腺苷核苷酸降解。所提出的分析方法強(qiáng)調(diào)了肉類(lèi)代謝組分析在區(qū)分輻照肉類(lèi)和未處理肉類(lèi)方面的有用性。

02、動(dòng)物友好型飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)雞大腿肉品質(zhì)、儲(chǔ)存穩(wěn)定性和代謝組學(xué)特征的影響

本研究使用基于核磁共振的代謝分析，調(diào)查了合法批準(zhǔn)的動(dòng)物友好型飼養(yǎng)環(huán)境對(duì)雞大腿肌肉理化質(zhì)量和儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。一天大的?Cobb?小雞在室內(nèi)系統(tǒng)中的常規(guī)或動(dòng)物友好型農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)?35?天。將來(lái)自傳統(tǒng)農(nóng)場(chǎng)?(CB)?的雞大腿肉和來(lái)自合法批準(zhǔn)的動(dòng)物友好型農(nóng)場(chǎng)?(AFB)?的雞大腿肉儲(chǔ)存?7?天，并分析肉類(lèi)的代謝組學(xué)特征和特征?；谒鼈兊拇x組學(xué)特征，通過(guò)偏最小二乘判別分析清楚地分開(kāi)了兩組雞。糖酵解相關(guān)產(chǎn)物（葡萄糖和乳酸）在?AFB?中更豐富，而肌苷、次黃嘌呤和游離氨基酸在?CB?中的含量更高。動(dòng)物友好的飼養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致AFB的代謝途徑和理化質(zhì)量的差異調(diào)節(jié)，與CB相比，其pH和持水能力較低，剪切力較高。然而，兩組雞在微生物質(zhì)量、脂質(zhì)氧化、揮發(fā)性堿性氮和脂肪酸譜方面都保持了儲(chǔ)存穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，動(dòng)物友好的飼養(yǎng)環(huán)境可能通過(guò)代謝變化導(dǎo)致肉質(zhì)的差異。

03、基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)揭示添加中鏈單酸甘油酯對(duì)雞肉的改善作用：味道、鮮肉質(zhì)量和成分

本研究旨在揭示中鏈甘油單酯?(MG)?補(bǔ)充劑引起的雞肉鮮肉質(zhì)量、成分和味道的差異。結(jié)果表明，添加?MG?可改善雞湯和肉味。上調(diào)升-carnosine，肌氨酸，尿苷和促成了鮮味和肉味的MG組的雞湯煙酰胺。膳食MG增加了雞胸肉肌肉中的總超氧化物歧化酶活性和氨基酸含量，并降低了丙二醛含量和滴水損失。此外，肉類(lèi)代謝組顯示肌酸、甜菜堿、l-鵝肌氨酸、肌苷?5′-單磷酸、次黃嘌呤、肌苷和磷脂，以及氨基酸和嘌呤代謝途徑，與通過(guò)添加?MG?改善肉雞的肉質(zhì)、成分和味道有關(guān)。總之，這些發(fā)現(xiàn)提供了證據(jù)，證明添加?MG?可以改善肉雞的鮮肉質(zhì)量、成分和味道。

04、基于?LC-MS?的代謝組學(xué)揭示了山羊肉輻照過(guò)程中代謝物的動(dòng)態(tài)變化

本研究應(yīng)用LC-MS非靶向代謝組學(xué)方法來(lái)鑒定輻照山羊肉的化學(xué)成分，并研究輻照對(duì)其代謝特征的影響和肉質(zhì)。共有?103?種代謝物被確定為負(fù)責(zé)輻照山羊肉代謝變化的差異代謝物，它們參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代謝和嘌呤代謝。包括氨基酸、核苷酸及其衍生物的差異代謝物被確定為輻照過(guò)程中肉質(zhì)的鑒別因素。具體而言，L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、鳥(niǎo)苷、鳥(niǎo)嘌呤、肌酐、谷胱甘肽和煙酸增加，而肌苷?5′-單磷酸?(IMP)?和鳥(niǎo)苷?5′-單磷酸?(GMP)?減少。總體而言，除?L-苯丙氨酸和鳥(niǎo)嘌呤外，其他相關(guān)代謝物均隨儲(chǔ)存顯著減少。本研究有助于從分子水平全面了解輻照劑量和貯藏時(shí)間對(duì)山羊肉代謝的影響，從而評(píng)價(jià)輻照山羊肉的質(zhì)量。線(xiàn)性度令人滿(mǎn)意的結(jié)果?(R2??>?0.995)、精密度（RSD小于8.9%）和回收率（83%-106%），表明非靶向代謝組學(xué)方法適用于監(jiān)測(cè)輻照山羊肉中小分子代謝物的變化，輻照是可行的山羊肉的保鮮方法。

如果您該非靶向代謝組學(xué)測(cè)序感興趣，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將為您免費(fèi)進(jìn)行文章思路方案設(shè)計(jì)。

對(duì)缺失值的處理，簡(jiǎn)單粗暴的方法是直接去除所有含有缺失的代謝物，對(duì)于一些代謝物如果是在樣本中大量缺失（比如超過(guò)了50%）確實(shí)可以舍棄，而少量缺失如果丟棄則可能會(huì)丟失一些有重要生物學(xué)意義的代謝物，所以對(duì)于少量缺失，較為穩(wěn)妥的辦法就是用值填補(bǔ)。比較簡(jiǎn)單的方法是用0值、均值、中值或最小值的一半進(jìn)行填補(bǔ)，復(fù)雜一點(diǎn)的則是使用機(jī)器學(xué)習(xí)的算法如鄰近算法（KNN）、隨機(jī)森林（RF）、奇異值分解（SVD）等方法。由于代謝組目前可分為靶向和非靶向兩大類(lèi)型，在不同的類(lèi)型中往往是采取不同的處理辦法。有研究者認(rèn)為非靶向的推薦使用KNN算法（Do et al.,2018）；也有認(rèn)為GC-MS數(shù)據(jù)使用隨機(jī)森林方法（Gromski et al.,2014）；還有的則認(rèn)為需要按缺失類(lèi)型，對(duì)于完全非隨機(jī)缺失的可使用最小值的一半進(jìn)行填補(bǔ)，完全隨機(jī)缺失或隨機(jī)缺失的使用隨機(jī)森林方法（Wei et al.,2018）。所以目前沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

標(biāo)準(zhǔn)化主要是為了去除實(shí)驗(yàn)、技術(shù)等帶來(lái)的誤差，常見(jiàn)的方法有：內(nèi)標(biāo)，即代謝物除以?xún)?nèi)標(biāo)豐度，可用于GC-MS；總峰面積標(biāo)準(zhǔn)化，即代謝物除以所有代謝物的總峰面積，可用于非靶向LC-MS；對(duì)數(shù)變換即直接對(duì)豐度取對(duì)數(shù)，LC-MS和GC-MS都有用到；PQN （Probabilistic Quotient Normalization）即每個(gè)代謝物除以了一個(gè)稀釋因子，這個(gè)因子則是依賴(lài)于樣本與參考樣本比值的分布，在NMR分析中被認(rèn)為是一種穩(wěn)健的方法；此外還有均值標(biāo)準(zhǔn)化、分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、中值標(biāo)準(zhǔn)化、z-score標(biāo)準(zhǔn)化等（Li et al.,2017），這些方法也可以結(jié)合使用（Di et al.,2016）。不同方法可能會(huì)引起不同分析目的的差異，比如進(jìn)行差異分析的時(shí)候，使用分位數(shù)方法可能比PQN方法好，而在進(jìn)行代謝標(biāo)志物篩選時(shí)，則表現(xiàn)差不多（Li et al.,2017）。因此，在分析的時(shí)候也可多嘗試一些標(biāo)準(zhǔn)化的方法。

總的來(lái)說(shuō)，缺失值和標(biāo)準(zhǔn)化的處理方法目前并無(wú)完全統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，需要結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)方法、目的進(jìn)行多次的調(diào)試以達(dá)到所期望的目標(biāo)。目前，百邁客云上的代謝組分析平臺(tái)已包含上述部分處理方法，操作簡(jiǎn)單，分析速度快，后續(xù)也會(huì)不斷增加更多的處理方式以滿(mǎn)足不同需求。

參考文獻(xiàn)：

[1]?Do K T, Wahl S, Raffler J, et al. Characterization of missing values in untargeted MS-based metabolomics data and evaluation of missing data handling strategies[J]. Metabolomics, 2018, 14(10): 128.

[2] Gromski P, Xu Y, Kotze H, et al. Influence of missing values substitutes on multivariate analysis of metabolomics data[J]. Metabolites, 2014, 4(2): 433-452.

[3] Wei R, Wang J, Su M, et al. Missing value imputation approach for mass spectrometry-based metabolomics data[J]. Scientific reports, 2018, 8(1): 663.

[4]?Di Guida R, Engel J, Allwood J W, et al. Non-targeted UHPLC-MS metabolomic data processing methods: a comparative investigation of normalisation, missing value imputation, transformation and scaling[J]. Metabolomics, 2016, 12(5): 93.

[5]?Li B, Tang J, Yang Q, et al. NOREVA: normalization and evaluation of MS-based metabolomics data[J]. Nucleic acids research, 2017, 45(W1): W162-W170.