Ps:李順昌教授團隊多次合作利用轉(zhuǎn)錄組測序全面精準(zhǔn)揭示糖尿病相關(guān)發(fā)病機制和治療策略，其實驗方案設(shè)計值得大家借鑒參考。

研究背景

心臟重構(gòu)和功能障礙是糖尿病常見的并發(fā)癥，常導(dǎo)致嚴重的心血管事件。MOTS-c是一種線粒體衍生肽，通過加速葡萄糖攝取和提高胰島素敏感性來調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)，MOTS-c不僅可改善心臟與血管內(nèi)皮功能，且其含量在糖尿病患者血漿中明顯下降，使其成為糖尿病心血管并發(fā)癥的一個新的治療靶點。所以，該研究旨在探究MOTS-c對糖尿病心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)挖掘其中的分子機制。

材料方法

對照組（C，n?= 10）和糖尿病前組（PD，n?= 30）。PD組的大鼠服用含有67%正常顆粒、10%豬油、20%蔗糖、2%膽固醇和1%膽酸鈉（16）的高脂肪飲食7周，糖尿病大鼠被隨機分為兩組：（1）糖尿病組（未經(jīng)治療）（D），（2）用MOTS-c（M）治療的糖尿病大鼠，取對照組（C）、未治療組（D）、治療組（M）大鼠心臟組織，進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。

研究思路

研究結(jié)果

1. MOTS-c顯著降低糖尿病空腹血糖與胰島素抵抗

MOTS-c治療8周后，D組和M組大鼠體重低于C組（圖1a和圖1e）。與D組相比，M組大鼠空腹血糖水平降低（圖1b）。此外，與C組相比，D組和M組大鼠胰島素水平下降，D組和M組間胰島素水平無顯著差異（圖1c）。通過計算HOMA-IR指數(shù)評估胰島素抵抗。與C組相比，D組大鼠的HOMA-IR指數(shù)顯著升高，而M組大鼠HOMA-IR指數(shù)較D組降低。

圖1. MOTS-c干預(yù)后各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、HOMA-IR與體重的變化

2. MOTS-c有效改善糖尿病心臟結(jié)構(gòu)和功能

該研究利用透射電鏡測定了MOTS-c對糖尿病心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。糖尿病引起心肌纖維排列紊亂和線粒體結(jié)構(gòu)的異常改變，包括心肌細胞排列不規(guī)則、嵴破裂、腫脹和空泡化（圖2）。MOTS-c治療糖尿病大鼠顯著降低心肌線粒體損傷，改善心肌纖維和線粒體結(jié)構(gòu)（圖2）。研究還通過測定檸檬酸合酶的活性，測定了線粒體功能。D組大鼠檸檬酸合酶的活性顯著降低，C組和M組的檸檬酸合酶的活性無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3g）。

使用M型超聲心動圖測定大鼠心臟功能。D組大鼠LVPWd值明顯升高，提示左心室出現(xiàn)病變（圖3d）。與C組相比，D組大鼠EF值下降（圖3b），提示糖尿病對照組大鼠心臟收縮功能受損。D組糖尿病大鼠的E峰值和A峰值均下降，而A峰值下降更快，因此增加了E/A比值（圖3c、3e和3f）。M組和C組在EF、E/A、LVPWd、E峰值和A峰值方面均無差異（圖3b-3f），表明MOTS-c心臟舒張功能和收縮功能。

圖2. 各組大鼠心肌組織透射電鏡圖像

圖3. 各組大鼠超聲心動圖影像與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3. 差異表達基因的篩選

為了進一步探究糖尿病大鼠對MOTS-c的適應(yīng)性反應(yīng)的機制，研究者利用RNA-Seq技術(shù)，測定了心肌組織基因全長轉(zhuǎn)錄表達。以C組為對照，D組表現(xiàn)出的差異表達基因（DEGs）即致病基因，再以D組為對照組篩選出M組的差異表達基因，二者篩選出的DEGs中重疊的基因即為MOTS-c改變的致病基因。將以上步驟執(zhí)行，篩選出47個MOTS-c改變的致病基因（圖4a）。將這47個基因進行熱圖分析后發(fā)現(xiàn)，C組基因表達趨勢與D組相反，而與M組近似（圖4b）。

圖4. 差異表達基因的篩選

4.差異表達基因的功能富集分析

采用Gene Ontology（GO）與Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）對MOTS-c所改變的47個致病基因進行功能富集分析。GO 注釋系統(tǒng)包含三個主要分支，即：生物學(xué)過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組分（CC）。）8 周 MOTS-c 注射所改變的 47 個糖尿病致病基因共富集于 195 個 GO term 中，其中 188 個 term 富集于 BP，2 個 term 富集于 CC，5 個 term 富集于MF。經(jīng)過 ClueGO 聚類分析后，195 個 term 主要富集于 9 個類別（見圖 5b），分別為血管生成（angiogenesis）、凋亡過程調(diào)控（regulation of the apoptotic process）、MAPK 級聯(lián)調(diào)控（regulation of MAPK cascade）、蛋白激酶活性正調(diào)控（positive regulation of protein kinase activity）、脂肪酸代謝過程（fatty acid metabolic process）、吞噬作用調(diào)節(jié)（regulation of phagocytosis）、蛋白激酶 B 信號正調(diào)控（positive regulation of protein kinase B signaling）、ERK1/2 級聯(lián)（regulation of ERK1/2 cascade）、膠質(zhì)生成（gliogenesis）和白細胞介素-1 的產(chǎn)生（interleukin-1 beta production）。KEGG通路富集分析顯示，18條KEGG通路顯著富集（圖5b），其中5條信號通路與免疫、凋亡和糖代謝相關(guān)（ErbB信號通路、補體和凝血級聯(lián)、c型凝集素受體信號通路、PI3K-Akt信號通路和AGE-RAGE信號通路）。在功能富集通路注釋基因中，ALOX15、ATF3、CCN1、EGR1、EGR3、ERRFI1、THBS1、TLR2和NRG1高頻率注釋。CCN1與EGR1基因高表達，同時均注釋在凋亡相關(guān)的GO term中，而CCN1也注釋于富集顯著性最高的ERK1/2級聯(lián)通路中，表明CCN1、ERK1/2與EGR1可能是相互關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因。

圖5. GO與KEGG功能富集分析

5. MOTS-c對CCN1 / ERK1/2 / EGR1信號通路的影響

為了驗證CCN1、ERK1/2與EGR1是否在MOTS-c改善糖尿病心臟結(jié)構(gòu)與功能中發(fā)揮重要作用，也為了進一步探究MOTS-c對線粒體發(fā)生的作用，研究者利用RT-PCR與Western Blotting技術(shù)測定了CCN1、ERK1/2、EGR1的基因表達與蛋白表達以及線粒體發(fā)生標(biāo)志蛋白PGC-1α的蛋白表達。結(jié)果表明，MOTS-c治療后，糖尿病大鼠心肌中PGC-1α蛋白表達顯著上升（圖7a）；CCN1、ERK1/2和EGR1基因表達顯著降低（圖6）；CCN1、EGR1蛋白表達顯著降低，ERK1/2的總蛋白表達量不變（圖7），但多個研究表明MOTS-c僅影響ERK1/2的磷酸化水平。

圖6. 各組大鼠心肌中CCN1、ERK1/2與EGR1的基因表達和蛋白表達

研究結(jié)論

為期8周的MOTS-c治療減少了糖尿病患者的心功能障礙與線粒體損傷，MOTS-c可能是通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和細胞凋亡產(chǎn)生作用。CCN1/ERK1/2/EGR1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能在MOTS-c抑制心肌細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

參考文獻

Manda Wang, Gangqiang Wang, Shunchang Li, et al. MOTS-c repairs myocardial damage by inhibiting the CCN1/ERK1/2/EGR1 pathway in diabetic rats. Front. Nutr., 04 January 2023Sec.

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轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析目前比較模式化，要想贏得審稿人青睞，必須要結(jié)合具體的科學(xué)問題做針對性展示。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析挖掘幾步走？我們將眾多的分析內(nèi)容歸納為4大類：所有基因挖掘、差異基因挖掘、表達量挖掘、高級工具挖掘。

1、所有基因挖掘

針對所有檢測到的基因，我們可以用基因名稱、功能注釋、序列信息等進行檢索篩選；基于篩選的關(guān)鍵基因或者前期研究結(jié)果，重點關(guān)注某類基因家族，從序列信息比對、功能結(jié)構(gòu)域保守性分析、家族進化樹分析、表達模式分析等進行研究，進而解析基因家族與生物學(xué)性狀的關(guān)系。

2、差異基因挖掘

差異基因挖掘是基于差異基因篩選，實現(xiàn)不同分組間差異表達基因的比較、功能注釋和通路富集分析等，解析參與生物學(xué)過程的關(guān)鍵基因及其功能。

3、表達量挖掘

表達量挖掘可以根據(jù)各個基因的表達量，實現(xiàn)不同樣品中共同表達和特異表達的基因的篩選，如組織特有表達基因篩選、不同處理樣品間特異表達基因篩選、不同發(fā)育時期特異表達基因篩選等，并對特定基因進行后續(xù)功能分類分析，如聚類分析，表達模式分析等。

4、高級工具挖掘

高級工具挖掘主要是整合基因表達量與表型數(shù)據(jù)、互作信息、其他組學(xué)信息，進行基因共表達網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖、組學(xué)聯(lián)合分析等，解析基礎(chǔ)代謝過程和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

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研究背景

水稻是最重要的糧食作物之一，在過去的50年里，通過雜交育種已經(jīng)大幅度提高了水稻的產(chǎn)量。然而雜交育種最近幾年也遇到了瓶頸，多倍體化則成為水稻育種的另一條思路。多倍體化能夠提高優(yōu)勢基因發(fā)生重組和相互作用的可能性，提高水稻對環(huán)境的適應(yīng)能力。

同源四倍體水稻（autotetraploid rice）是二倍體水稻經(jīng)過染色體加倍形成的新種質(zhì)。同源四倍體水稻亞種間雜種F1具有強大的生物學(xué)優(yōu)勢，蘊含著巨大的增產(chǎn)潛力，可望成為未來水稻育種的新途徑。然而，其雜種F1普遍存在育性偏低，產(chǎn)量優(yōu)勢難以發(fā)揮，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上難以直接應(yīng)用的問題。所以，如何創(chuàng)制育性正常且能克服雜種F1不育性的新型四倍體（neo-tetraploid）是利用其優(yōu)勢的關(guān)鍵。

為了避免同源四倍體水稻育性偏低的問題，華南農(nóng)大某研究組經(jīng)過20年的努力，培育出2個新型四倍體水稻，其結(jié)實率可達80%以上，于2016年獲得國家植物新品種權(quán)。本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組測序，研究新型四倍體（Huaduo 3）與同源四倍體雜交F1代的花藥、子房和葉片的基因表達情況，為解析新型四倍體育性和雜種優(yōu)勢的分子機制打下基礎(chǔ)。

材料方法

新型四倍體水稻Huaduo 3（H3），40種不同的同源四倍體水稻，以及雜交F1代。同源四倍體水稻 Huajingxian 74-4x（T452）與H3的雜交F1代用于測序分析。
轉(zhuǎn)錄組測序：取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉。每個組織每種品系有3個生物學(xué)重復(fù)，共27個樣品。測序平臺為Illumina HiSeq 2500，平均每個樣品測約5G。
小RNA測序：取T452，H3及雜交F1代的減數(shù)分裂階段的花藥進行小RNA測序，無生物學(xué)重復(fù)。
全基因組重測序：兩個親本T452和H3的葉片DNA用于全基因組重測序。
嗯，測序手段還是挺多滴！

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.新型四倍體水稻Huaduo 3（H3）的育種及其與其它四倍體水稻的雜交過程
將兩種同源四倍體水稻（Jackson-4x和96025）進行雜交，獲得F1代雜交種。F1代雜交種再進行連續(xù)自交，到F5代時發(fā)現(xiàn)一株水稻有80%的結(jié)實率，這株水稻經(jīng)過多代連續(xù)自交，到F10-F13代時出現(xiàn)可以穩(wěn)定遺傳的高結(jié)實率性狀，這個品系被命名為Huaduo 3（H3）。H3不僅結(jié)實率高，還有其它高產(chǎn)性狀（表1），其花粉母細胞有90%以上是正常的。
將H3與40種其它品系的同源四倍體水稻（26個印度種和14個日本種）進行雜交，獲得的40種F1代表現(xiàn)出了很多大大優(yōu)于親本的性狀，尤其是單株谷粒數(shù)、結(jié)實率、單株產(chǎn)量等性狀。為了進一步研究雜交F1代的雜種優(yōu)勢，我們挑選了T452和H3的雜交F1代進行轉(zhuǎn)錄組研究。T452是一種育性較低的同源四倍體，雜交F1代的高親優(yōu)勢幾乎都是正的，除了谷粒長度和10谷粒寬度兩個指標(biāo)。雜交F1代的中親優(yōu)勢除了10谷粒寬度這一個指標(biāo)以外都是正的，說明雜交F1代表現(xiàn)出了明顯的雜種優(yōu)勢。
高親優(yōu)勢（High-parent heterosis，HPH）是指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與高值親本（HP）同一性狀數(shù)值差值的比率。高親優(yōu)勢（%）=(F1-HP)/HP*100%。
中親優(yōu)勢（Mid-parent heterosis，MPH）指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與雙親（P1和P2）同一性狀的平均值差值的比率。中親優(yōu)勢（%）=[F1-(P1+P2)/2]/(P1+P2)/2*100%。

表一：T452與H3雜交F1代的雜種優(yōu)勢。HPH：高親優(yōu)勢；MPH中親優(yōu)勢；PH：植株高度；EP：單株谷粒數(shù)；FG：單花谷粒數(shù)；SS：結(jié)實率；GYP：單株產(chǎn)量；GL：10谷粒長度；GW：10谷粒寬度。

圖1：親本和雜交F1代的表型。（A）Jackson-4x（T45），Huaduo 3（H3）與96025（T44）的谷粒大小，H3是來自T45和T44的雜交；（B）H3在大田中的長勢；（C）T45，H3，T44的植物表型；（D）Shennong15-4x（T424），H3，以及兩者雜交F1代的表型。

2.轉(zhuǎn)錄組測序
因為T452和H3的雜交F1代表現(xiàn)出了優(yōu)良性狀，因此可以通過轉(zhuǎn)錄組測序研究性狀差異的原因。取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉(zhuǎn)錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉?？偣矞y了548M clean reads，平均有89.06%的reads可以比對到參考基因組上，其中93.45%都是比對到唯一位置上。三個生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性都達到了0.8以上。用qRT-PCR的方法對12個差異表達基因（DEG）的表達量進行了驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致。對不同樣品進行層次聚類分析表明，相同組織的樣品總能聚到一塊（圖2）。

圖2：所有基因的層次聚類分析。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

3.差異表達基因（DEG）分析及注釋
在三個不同株系中共發(fā)現(xiàn)17877個DEG，兩兩比較的DEG數(shù)目在1521到2498之間（表2）。F1和親本之間的DEG稱為DEGF，親本之間的DEG稱為DEGP。DEGF的基因能分為兩個不同的組，其中一個組在DEGP里面也有，另一個組只屬于DEGF，后者被稱為DEGFu。這些DEGFu基因能夠解釋F1和親本之間的表型差異，因此接下來的研究種重點關(guān)注DEGFu基因。在這17877個DEG里面，有1150，1014，1122個DEGFu與花藥、子房、葉片有關(guān)，其中分別有807，663，866個基因與花藥、子房、葉片特異相關(guān)，這些基因被稱為DEGFu-sp。

表2：三個不同組織中的差異表達基因統(tǒng)計。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

為了研究DEGFu-sp基因的功能，我們首先研究了其中的轉(zhuǎn)錄因子，共發(fā)現(xiàn)了44個轉(zhuǎn)錄因子，花藥里面16個，子房里面10個，葉片里面18個。對DEGFu-sp基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明這些基因相互之間有顯著的聯(lián)系，多個代謝通路富集程度較高。

GO富集分析表明花藥中的DEGFu-sp基因有19個生物學(xué)過程類別顯著富集，包括光合作用、代謝途徑、合成調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。6個通路類別顯著富集，包括光合作用和代謝通路。13個基因在F1中的表達量顯著高于T452。在807個花藥特異的DEGFu-sp中，15個基因與46個其它重要基因共表達。

接下來用同樣的方法對子房和葉片中的DEGFu-sp基因進行了GO富集分析。在葉片當(dāng)中有5個基因在F1中表達量顯著高于T452。H3水稻葉片在開花過程中顏色逐漸變化，而T452葉片在開花過程中顏色保持不變。因此，我們比較了葉片中F1比T452上調(diào)的基因，以及H3比T452上調(diào)的基因，兩者有74.01%的重合。有趣的是，在葉片中發(fā)現(xiàn)了兩個主要的功能基因類別，分別是程序性細胞死亡和防御反應(yīng)。

4. 花藥特異性差異表達基因與減數(shù)分裂有關(guān)

因為T452育性較低，而F1代育性較高，為了研究育性的差異，我們重點研究了F1花藥中與T452相比上調(diào)的基因。首先，有643個基因在F1花藥中與T452相比特異上調(diào)，這其中排除了H3與T452相比上調(diào)的基因。對這643個基因進行GO分析表明，有6個功能基因類別富集，這些基因與防御反應(yīng)、光合作用、細胞凋亡和程序性細胞死亡有關(guān)。這其中有41個基因在育性較低的同源四倍體中表達量低于二倍體。在這41個基因中，4個基因，LOC_Os04g33830，LOC_Os12g08770，LOC_Os06g21590，LOC_Os07g25430，與光合作用有關(guān)。

接下來，將這643個特異上調(diào)的基因與野生型水稻花藥減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達量相互比較，發(fā)現(xiàn)有9個基因都在減數(shù)分裂前期到四分體期表達。

隨后，我們比較了花藥特異性差異表達基因DEGFu-sp和野生型水稻減數(shù)分裂相關(guān)基因表達數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)有42個減數(shù)分裂特異性基因和8個減數(shù)分裂相關(guān)基因（圖3）。在8個減數(shù)分裂相關(guān)的基因中，有兩個基因和DNA修復(fù)和染色體結(jié)構(gòu)有關(guān)。

因為轉(zhuǎn)錄組也會被表觀遺傳調(diào)控，我們也進了小RNA測序。在花藥中發(fā)現(xiàn)了288個差異表達的miRNA（DER），其中有13個為新發(fā)現(xiàn)的。在這288個DER中，有38個只在F1與親本相比中特有，這38個基因被稱為DERFu。這38個DERFu有397個靶標(biāo)基因。GO分析表明這397個靶標(biāo)基因有7個功能基因類別富集，這些基因與細胞凋亡、防御反應(yīng)、程序性細胞死亡、細胞自噬、DNA完整性和脅迫反應(yīng)有關(guān)。而且，大部分靶標(biāo)基因同于F1或者H3中上調(diào)的基因。然后我們比較了這38個DERFu與之前發(fā)現(xiàn)的差異表達miRNA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中一個miRNA，osa-miR5072_L-2_1ss3AG，在

Taichung65-2x和 Taichung65-4x水稻中的四倍體中下調(diào)。這個miRNA靶標(biāo)基因為 LOC_Os02g24960，是一個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因。

圖3：與育性和雜種優(yōu)勢相關(guān)的基因在染色體上分布。紅色為葉片中的基因，藍色為花藥中的基因，黑色為子房中的基因。

表3：花藥中的差異表達miRNA（DER）列表

5.雜交F1代非累加基因表達
F1代表達的基因可以分成兩個類別，一類是累加基因，一類是非累加基因。累加基因的表達量來自兩個親本的等位基因之和，非累加基因的表達量由兩個親本等位基因的平均值決定。在三個組織中共發(fā)現(xiàn)了1224個非累加基因（NDEG），在花藥、子房和葉片中分別為314個，578個，332個。其中895個上調(diào)，329個下調(diào)。通過對花藥NDEG和水稻花藥減數(shù)分裂特異性基因表達數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)了53個共有的基因。其中有7個基因在四倍體中表達量低于二倍體水稻。

表4：非累加表達基因（NDEG）和DEGFu及不同組織的DEGFu-sp數(shù)量統(tǒng)計。星號表示NDEG在F1表達的總基因中的比例。

6.DNA序列差異與雜交F1代的差異表達基因之間的關(guān)系
DNA重測序表明T452和H3有很多序列差異，兩者共有2351039個SNP，其中1192412個SNP在T452中特異存在，374460個SNP在H3中特異存在。兩者共有499448個Indel，其中248194個Indel在T452中特異存在，84196個Indel在H3中特異存在。將T452和H3相比，SNP和Indel多態(tài)性分別為66.77%和69.97%。在這些多態(tài)性位點中，約65%的SNP和72%的Indel在基因區(qū)。47.67%的SNP和53.37%的Indel位于差異表達基因的調(diào)控區(qū)域。另外，有58908個SNP和5561個Indel位于基因編碼區(qū)。
因為T452和H3存在大量的DNA序列差異，我們分析了DEGFu-sp中基因的DNA序列差異，結(jié)果表明花藥、子房和葉片中分別有330個、291個、459個基因存在DNA序列差異（SNP或Indel）?；ㄋ幭嚓P(guān)的330個基因可以分為15個不同的生物學(xué)過程類別，主要和光合作用、細胞代謝、轉(zhuǎn)錄和生物合成有關(guān)。子房相關(guān)的基因有1個生物學(xué)過程富集，即代謝通路。同樣的，葉片相關(guān)的基因有8個生物學(xué)過程富集，包括氮代謝、細胞運輸?shù)?。這些富集的生物學(xué)過程基本上與DEGFu-sp富集的生物學(xué)過程一致。
另外，非累加差異表達基因中也有SNP和Indel，花藥、子房和葉片中分別有67個、133個、87個基因存在DNA序列差異，并對這些基因進行了富集分析。其中25個基因為轉(zhuǎn)錄因子。

結(jié)論

本研究培育了一個新型四倍體水稻H3，H3與同源四倍體T452雜交產(chǎn)生的F1代具有育性高、產(chǎn)量高等優(yōu)良的雜種優(yōu)勢性狀。通過比較H3，T452，以及雜交F1代的三個不同組織（花藥、子房、葉片）的轉(zhuǎn)錄組差異，尤其是重點分析了花藥的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了多個與減數(shù)分裂有關(guān)的差異表達基因，這些基因可能與雜種優(yōu)勢有關(guān)。對花藥的小RNA測序也找到了一些F1中差異表達的miRNA，這些miRNA的靶基因也與轉(zhuǎn)錄組測序中上調(diào)的基因有大部分重合，說明miRNA可能參與調(diào)控了雜交F1代的性狀差異。對兩個親本DNA序列的差異進行全基因組重測序分析，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，找到了DNA層面上兩者育性差異的可能原因。

創(chuàng)新點

培育出高結(jié)實率的新型四倍體水稻，可以用于四倍體水稻育種；
轉(zhuǎn)錄組測序比較了新型四倍體水稻，同源四倍體水稻及雜交F1代不同組織的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了影響四倍體水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因；
小RNA測序和全基因組重測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，深入解析性狀差異原因。

點評

這篇文章選取的實驗材料很好，性狀優(yōu)良，而且研究得很深入，比較了三種水稻三個不同組織的轉(zhuǎn)錄組，還進行了小RNA測序和全基因組重測序。通過深入分析，找到了一些影響水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因，為后續(xù)的育種工作打下了基礎(chǔ)。
對多種測序手段結(jié)合分析感興趣的小伙伴快來試試吧！

參考文獻

Guo H, Mendrikahy J N, Lei X, et al. Transcriptome analysis of neo-tetraploid rice reveals specific differential gene expressions associated with fertility and heterosis[J]. Scientific reports, 2017, 7:40139.

有沒有什么辦法，降低洋蔥辛辣的刺激性，提高洋蔥的甘甜的口感呢？

2016年9月，百邁客與北京農(nóng)林科學(xué)院蔬菜所的一項研究為解決這個問題提供了理論基礎(chǔ)。前人已有的研究表明，淀粉或蔗糖代謝在球莖的形成和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。為了分析洋蔥在球莖膨大過程中蔗糖的代謝和甜味的發(fā)展情況，我們利用RNA-seq對三個不同發(fā)育階段的洋蔥球莖進行轉(zhuǎn)錄組測序。

英文名稱：Transcriptome Analysis of Sucrose Metabolism during Bulb Swelling and Development in Onion (Allium cepa L.)
雜志：frontiers in plant science
影響因子：4.495

實驗材料

洋蔥球莖，每組樣本3個生物學(xué)重復(fù)。

DAS：day after swelling。

實驗思路

文章結(jié)果

經(jīng)過測序分析，我們最終鑒定了參與洋蔥球莖形成和發(fā)育的差異表達基因，篩選出與蔗糖、葡萄糖和果糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1.質(zhì)量評估和數(shù)據(jù)過濾后共獲得72.53M clean reads。Q30在85%以上。說明測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和數(shù)據(jù)量滿足后續(xù)分析。用trinity將reads組裝到79376條Unigenes，平均長度為678bp。ContigN50為1093bp。

2.用BLASTX將組裝得到的序列與Nr，Swiss-Prot，GO，COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，共有8288個Unigenes注釋到了25個COG類別中的11713個功能。有585個Unigenes注釋到“碳水化合物的運輸和代謝”。

3.為了鑒定在洋蔥球莖膨脹過程中活躍的通路，將得到的unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)參考通路進行比對。15 DAS vs. 30 DAS注釋到了95個pathway，15 DAS vs. 40 DAS 注釋到了79個pathway，30 DAS vs. 40 DAS注釋到了86個pathway。共有6113個unigenes注釋到了120條KEGG通路中?！暗矸酆驼崽谴x”構(gòu)成了各樣本文庫中的初級代謝途徑，并有可能在球莖膨大和發(fā)育過程中活性更高。

4.設(shè)置P < 0.01和|log2 (fold change)|≥1，篩選出在球莖發(fā)育過程中的差異表達基因。在3個不同發(fā)育階段共獲得5416個差異表達基因。為深入了解洋蔥發(fā)育過程中蔗糖代謝，結(jié)合文獻中的已有的報道并根據(jù)洋蔥RNA測序數(shù)據(jù)注釋中的關(guān)鍵詞搜索共列篩選出147個差異調(diào)控淀粉和蔗糖代謝的關(guān)鍵基因。根據(jù)洋蔥球莖發(fā)育過程中蔗糖、葡萄糖、果糖水平的變化，挑選出6個差異表達基因可能在洋蔥球莖發(fā)育早期發(fā)揮重要作用，分別為CWIN，SUT，SuSy (SuSy1，SuSy2)和INV (INV1，INV2)。

5.使用qRT-PCR驗證參與蔗糖代謝的差異表達基因。這6個差異表達基因的表達水平與RNA-seq結(jié)果是一致的。

結(jié)論

本研究結(jié)果表明，程序化的基因表達以及不同發(fā)育階段中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量變化對球莖膨大十分重要。這些發(fā)現(xiàn)對于我們理解洋蔥球莖發(fā)育的分子機制具有重要作用。相信在不遠的將來，這些理論基礎(chǔ)就會運用到實際當(dāng)中，提高洋蔥的糖分，降低氣味刺激性，到那時，媽媽再也不用擔(dān)心切洋蔥時會辣眼睛了。

參考文獻

Zhang C, Zhang H, Zhan Z, et al. Transcriptome Analysis of Sucrose Metabolism during Bulb Swelling and Development in Onion (Allium cepa L.)[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7.