1、固定
1.1植物組織
1)配置固定Buffer
| 試劑名稱 | 終濃度 |
| Hepes（pH 8） | 20mM |
| Sucrose | 250mM |
| MgCl2 | 1mM |
| KCl | 5mM |
| glycerol | 40%（V/V) |
| Triton X -100 | 0.25%（V/V) |
| PMSF | 0.1mM |
| 2-mercapto-ethano | 0.1%（V/V) |
2)實(shí)驗(yàn)步驟
A.收集4g新鮮、干凈、長(zhǎng)勢(shì)完全正常的幼嫩組織樣品（如有污物，需要提前處理干凈），并至于冰上
B.每2g收集的新鮮組織使用剪刀剪成碎片，各放置于一個(gè)50ml的離心管中
C.往50ml離心管中添加提前預(yù)冷的35ml固定Buffer和2ml 36%的甲醛溶液，室溫下，旋轉(zhuǎn)雜交爐或者其它可旋轉(zhuǎn)設(shè)備中旋轉(zhuǎn)反應(yīng)90min
D.加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)
E.濾掉固定液，用無菌ddH2O清洗幾次（至無泡沫）
F.吸干樣品表面水分，將樣品至于液氮中研磨
G.每4g研磨后的樣品存于一個(gè)50ml離心管中，并將離心管至于自封袋中，在-80℃保存?zhèn)溆?/p>
1.2動(dòng)物組織
1)取1g處理干凈的組織樣，將樣本置于液氮中充分研磨
2)將研磨后的組織置于預(yù)冷的50ml離心管中，加入30ml 1xPBS充分混勻
3)使用Falcon細(xì)胞網(wǎng)過篩2次（100um+40um），除去雜質(zhì)，收集濾液，加入35ul PMSF和適量的1x PBS，補(bǔ)至35ml
4)加入2ml 37%甲醛，室溫條件下置于旋轉(zhuǎn)搖床上反應(yīng)60min
5)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)
6)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀
1.3速凍植物組織
1)取50mg速凍組織樣于2ml國產(chǎn)離心管中，加入鋼珠，使用打碎儀液氮充分研磨
2)在研磨后的組織中加入1ml的NIBuffer工作液1中，震蕩混勻之后過100um的濾網(wǎng)，補(bǔ)充適量的NIBuffer工作液1至全部過濾完成，使用50ml離心管收集濾液（冰上操作）
3)在濾液中加入巰基乙醇、PMSF和37%甲醛溶液，室溫雜交反應(yīng)一定時(shí)間
4)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)
5)3000g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀
1.4細(xì)胞
1)用1ml 1x PBS重懸細(xì)胞樣品（要求客戶自己固定完成），轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中
2)4℃ 650g離心10min，棄上清
3)將1ml Lysis Buffe 工作液加入到裝有樣品沉淀的離心管中，充分混勻，重懸樣品
4)離心管放在冰上，并置于搖床上100r，混勻15min
5)650g，4℃，離心10min，棄掉上清，保留沉淀
1.5血液
1)取1ml新鮮全血至50ml離心管中，加入3ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻
2)冰上放置15min（每5min顛倒混勻一次）
3)4℃450g離心10min，棄掉上清
4)加入2ml的紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻白細(xì)胞
5)4℃450g離心10min，棄掉上清
6)加入45ml 1XPBS，重懸沉淀
7)加入2.5ml37%甲醛，充分混勻，室溫旋轉(zhuǎn)雜交60min
8)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脫色搖床100r混勻5min，終止交聯(lián)
9)650g 4℃離心5min，棄掉上清保留沉淀
2、細(xì)胞裂解和酶切
1)配置適當(dāng)裂解體系冰上裂解細(xì)胞
2)用梯度密度離心法從裂解的細(xì)胞中提取細(xì)胞核
3)用限制性內(nèi)切酶酶切細(xì)胞核
3、末端標(biāo)記和平端連接
1)配置適當(dāng)標(biāo)記體系對(duì)末端標(biāo)記生物素
2)將補(bǔ)平的末端用T4 DNA連接酶進(jìn)行平末端連接
4、DNA純化（解交聯(lián)）
1)配置解交聯(lián)反應(yīng)試劑
2)將解交聯(lián)反應(yīng)試劑加入樣品中，充分混勻，金屬浴55℃，900rpm反應(yīng)30min
3)加入適量的NaCl溶液，充分混勻，金屬浴65℃，900rpm反應(yīng)90min
4)反應(yīng)結(jié)束后5000rpm室溫離心3min，取上清液至新的離心管中
5)加入XP磁珠，混勻瞬時(shí)離心，室溫孵育10min
6)將樣品放置于磁力架上，直到液體澄清
7)小心棄掉上清液，加入200ul新鮮配置的80%乙醇，靜置20s，棄掉上清液
8)重復(fù)步驟7
9)取下離心管，瞬時(shí)離心，吸干凈殘留的液體
10)室溫靜置3min，待磁珠表面呈現(xiàn)磨砂狀
11)將離心管從磁力架上取下來，加入85ul EB，充分混勻磁珠，室溫靜置5min
12)將離心管置于磁力架上，待到液體澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中
5、Hi-C文庫制備（采用Mate-pair Kit）
5.1文庫制備流程
取1ug DNA樣品（體積最大取41ul）除去末端標(biāo)記但未連接的DNA，金屬浴反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)
1)Ampure XP磁珠純化DNA
A.取90ul的XP磁珠至上述反應(yīng)結(jié)束的離心管中，用移液器吹吸混勻，瞬離后室溫靜置5min
B.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液
C.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液
D.重復(fù)步驟C
E.取下樣品管，瞬時(shí)離心，吸干殘留的液體
F.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可
G.從磁力架上取下離心管，加入18ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min
H.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心吸取上清液至新的離心管中備用
2)片段化、末端修復(fù)及加A
A.取0.5ug（最大體積17ul）純化后的DNA
B.加入配置好的反應(yīng)試劑，混勻后瞬離
C.置于PCR儀中按照設(shè)置好的程序進(jìn)行反應(yīng)
3)接頭連接及純化
A.在反應(yīng)結(jié)束后的樣品中加入接頭連接需要的試劑
B.吹吸混勻，瞬離后置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)
C.在反應(yīng)結(jié)束的樣品中加入50ul的XP磁珠，混勻瞬離，室溫反應(yīng)5min
D.將樣品置于磁力架上，待液體澄清后，小心棄掉上清液
E.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液
F.重復(fù)步驟E
G.取下樣品管，瞬時(shí)離心，吸干殘留的液體
H.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可
I.從磁力架上取下離心管，加入28ul NF水，混勻重懸磁珠，室溫孵育5min
J.直到液體澄清后小心轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中
4)目標(biāo)捕獲
A.使用TWB和BB試劑重懸C1磁珠
B.取10ul重懸后的使用BB溶解的磁珠，加入純化后的樣品中
C.混勻后置于旋轉(zhuǎn)的混勻儀反應(yīng)15min
5)PCR文庫擴(kuò)增及片段篩選
A.將樣品置于磁力架上，待液體澄清之后棄掉上清液
B.分別使用200ul的BB試劑和NEB試劑重懸磁珠
C.棄掉上清，瞬離，離心管置于磁力架上，用槍頭吸干殘留的液體
D.室溫靜置2-4min，至磁珠表面無明顯水珠
E.取下離心管，加入10ul的NF水，重懸磁珠，用于PCR擴(kuò)增
F.配置好PCR擴(kuò)增試劑后，混勻，連同磁珠一起置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增
G.PCR結(jié)束后，將樣品置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液至新的離心管中
H.補(bǔ)水至50ul，并加入30ul的XP磁珠，吹吸混勻室溫靜置5min
I.置于磁力架上，待液體澄清后，棄掉上清
J.加入200ul新鮮配置的80%乙醇，室溫靜置20s，小心移除上清液
K.重復(fù)步驟J
L.取下樣品管，瞬時(shí)離心，吸干殘留的液體
M.將離心管重新置于磁力架上，室溫靜置2-4min，磁珠表面無明顯水珠即可
N.取下樣品管，加入30ul的Elution Buffer，混勻，瞬離，室溫靜置5min
O.置于磁力架上，待液體澄清后吸取上清液進(jìn)行文庫質(zhì)檢
5.2文庫質(zhì)檢
1)質(zhì)檢方法：文庫通過 Qsep-400 進(jìn)行片段質(zhì)檢， 使用酶標(biāo)儀進(jìn)行文庫濃度的定量
2)庫檢標(biāo)準(zhǔn)：庫檢片段呈正態(tài)分布狀，300bp起峰，800bp落峰；片段無前后拖尾、無接頭、無雜峰；濃度大于1ng/ul
5.3建庫用試劑耗材
1)文庫構(gòu)建試劑盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit? for I11umina 貨號(hào)ND617-02
2)產(chǎn)物純化磁珠：Agencourt? AMPure? XP，貨號(hào)A63882
3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標(biāo)準(zhǔn)DNA 卡夾
4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki
5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen
5.4建庫用設(shè)備
| 設(shè)備 | 廠家 |
| PCR儀 | Life |
| 金屬浴 | 天根 |
| 掌上離心機(jī) | 天根生化 |
| 漩渦震蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC |
| 移液槍 | RAININ 瑞寧 |
| 磁力架 | Life |
| 相機(jī) | 索尼 |
| 冰箱 | 海爾 |
| 四維旋轉(zhuǎn)儀 | 海門市其林貝爾儀器制造有限公司 |
| 質(zhì)檢使用儀器 | Bioptic-Qsep400 |
| 定量使用儀器 | 賽默飛Qubit 3.0??酶標(biāo)儀 |
6、測(cè)序方法
測(cè)序設(shè)備：NovaSeq X plus
測(cè)序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit
]]>期刊：Nature
導(dǎo)讀
在細(xì)胞周期的中間階段，染色質(zhì)以分級(jí)結(jié)構(gòu)排列在核中，這在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面具有重要作用。但是，人類胚胎發(fā)生過程中3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)力學(xué)仍然未知。在這里作者報(bào)告，與小鼠精子不同，人類精子細(xì)胞不表達(dá)染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑CTCF，其染色質(zhì)不包含拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域（TADs）。人類受精后，TAD結(jié)構(gòu)在胚胎發(fā)育過程中逐漸建立。此外，A / B區(qū)室化在人類胚胎2細(xì)胞階段中消失，并在后續(xù)胚胎發(fā)育過程中重新建立。值得注意的是，阻斷合子基因組激活（ZGA）可以抑制人類胚胎中TAD的建立，而不能抑制小鼠或果蠅中的TAD。值得注意的是，CTCF在ZGA之前以非常低的水平表達(dá)，然后在觀察到TAD時(shí)在ZGA階段高表達(dá)。CTCF基因被敲除后，胚胎中TAD結(jié)構(gòu)顯著減少，這表明合子基因組激活（ZGA）階段，人類胚胎中的TAD建立需要CTCF表達(dá)。結(jié)果表明，CTCF在人類胚胎發(fā)生過程中的3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)建立中具有關(guān)鍵作用。
實(shí)驗(yàn)方法
材料：小鼠精子和桑椹胚
方法：Hi-C, 免疫染色，DNA甲基化測(cè)序，ATAC-seq, RNA-seq，Smart-seq2
研究?jī)?nèi)容
1、人類早期胚胎的TAD結(jié)構(gòu)
作者檢測(cè)了人類精子和胚胎中的染色質(zhì)相互作用。但是沒有檢測(cè)到人類2細(xì)胞胚胎中TAD結(jié)構(gòu)的特征性“三角”相互作用。在8細(xì)胞胚胎中這些相互作用的水平很低，并且在人類胚胎發(fā)育過程中相互水平逐漸升高（圖1a）。為了排除read深度對(duì)分析的影響，在繪制每個(gè)階段的相互作用熱圖時(shí)，作者隨機(jī)選擇了相同數(shù)量的read。 作者進(jìn)一步調(diào)查了人類胚胎發(fā)育過程中的TAD重編程。使用TAD分離分?jǐn)?shù)方法（Methods）來獲得TAD結(jié)構(gòu)和TAD邊界。即使read深度很低，也可以檢測(cè)到大多數(shù)TAD域。作者還計(jì)算了TAD信號(hào)和方向指數(shù)。本文的數(shù)據(jù)表明，TAD信號(hào)方差和方向指數(shù)在2細(xì)胞階段最低，并隨著發(fā)育而逐漸增加（圖1b）。為了排除人胚TAD分析中可能的實(shí)驗(yàn)偏差，本文使用了小鼠morula胚胎作為對(duì)照，將其與人2細(xì)胞，8細(xì)胞和morula胚胎混合。然后，為這些混合樣品構(gòu)建了Hi-C庫。同時(shí)，還為未與人類樣品混合的小鼠桑morula胚胎生成了Hi-C庫。這些結(jié)果表明，混合樣品中的TAD結(jié)構(gòu)在人類2細(xì)胞胚胎中仍然模糊不清，在8細(xì)胞胚胎和桑胚胎中變得更清晰，而所有摻入的小鼠morula胚胎均清晰可見TAD結(jié)構(gòu)。來自混合樣品的TAD信號(hào)分析支持了作者的發(fā)現(xiàn)，即TAD結(jié)構(gòu)在人類胚胎發(fā)生過程中得以確立。
總之，這些數(shù)據(jù)表明，TAD結(jié)構(gòu)在人的2細(xì)胞胚胎中基本上不存在，在8細(xì)胞胚胎中很少存在，并且在胚胎發(fā)育過程中變得越來越明顯。
圖a 人類精子，人類胚胎和H1人類ES細(xì)胞（hESCs）中高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用熱圖，分辨率為40 kb（合并的生物學(xué)重復(fù)；n = 2-3）。
圖b 用相等數(shù)量的reads（每個(gè)階段從2-3個(gè)生物學(xué)復(fù)制中產(chǎn)生）計(jì)算出的人類胚胎中TAD信號(hào)的相對(duì)方差。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)染色體。顯示P值；雙面Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。
圖c 人類胚胎中500kb分辨率的5號(hào)染色體的PC1值軌跡和Pearson相關(guān)熱圖，具有相同的read次數(shù)（每個(gè)階段2-3次生物復(fù)制）。
圖d 具有相同reads的人胚胎中的compartment強(qiáng)度。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，通過自舉獲得（n = 100）。通過單側(cè)t檢驗(yàn)計(jì)算P值。
圖1. 人類精子和胚胎的三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)
2、人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)
先前的研究表明，TAD結(jié)構(gòu)存在于成熟的小鼠精子中。令人驚訝的是，本文沒有在人類精子中觀察到典型的三角TAD結(jié)構(gòu)（圖1a）。例如，人類精子的HOXA簇區(qū)域沒有TAD邊界，但存在于人類胚泡（圖2a）和小鼠精子中。為了驗(yàn)證該觀察結(jié)果，繪制了人類精子和胚泡在不同讀取深度下的TAD信號(hào)方差。與小鼠精子和人類胚泡不同，人類精子系的y截距接近0（圖2b），表明人類精子中不存在TAD。本文進(jìn)一步比較了人類精子和小鼠精子之間相互作用插入物大小的密度，結(jié)果表明，人類精子在4 Mb（中程）附近出現(xiàn)一個(gè)主峰，而小鼠精子在933 kb附近出現(xiàn)肩峰，在41 Mb左右出現(xiàn)遠(yuǎn)距離主峰。此外，人的精子和小鼠的精子之間的接觸概率衰減曲線也有差異?？傊?，這些結(jié)果表明人類精子不含TAD。
為了排除潛在的實(shí)驗(yàn)偏見，本文將小鼠精子與人類精子混合，并為精子混合物構(gòu)建了一個(gè)Hi-C庫（方法）。平行地，本文混合了人類HeLa細(xì)胞和小鼠HT22細(xì)胞。與本文之前的結(jié)果一致，本研究在精子混合物中觀察到了來自小鼠精子而非人精子的TAD。相比之下，在人類HeLa細(xì)胞和小鼠HT22細(xì)胞中均觀察到TAD結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了人類精子中沒有TAD。
CTCF-cohesin復(fù)合物在高級(jí)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有重要作用。本研究調(diào)查了人類和小鼠精子中CTCF和粘著蛋白的水平。RAD21是黏附蛋白復(fù)合物的一個(gè)亞基，存在于人類和小鼠的精子中）;但是，在人類精子中未檢測(cè)到CTCF，并且在使用短干擾RNA（siRNA）耗盡CTCF的細(xì)胞系中表達(dá)很弱，但是在小鼠精子，人類和對(duì)照小鼠細(xì)胞系中檢測(cè)到了CTCF（圖2c）。由于CTCF的消耗會(huì)導(dǎo)致TAD結(jié)構(gòu)的破壞，因此CTCF的缺乏可能是人類精子中TAD結(jié)構(gòu)喪失的基礎(chǔ)。
圖a 人類精子和胚泡中HOXA簇周圍的相互作用熱圖，分辨率為10 kb（生物學(xué)重復(fù); n = 3）。
圖b 人精子和胚泡中TAD信號(hào)方差與read深度（1 /讀取次數(shù)）的線性回歸曲線。在y軸上標(biāo)記了人類胚泡和精子的回歸線的線性外推。在每個(gè)讀取深度進(jìn)行降采樣分析3次（n = 3）。
圖c 用Ponceau染色的小鼠精子，人精子和體細(xì)胞系中CTCF的Western印跡。黑色箭頭表示CTCF波段。每個(gè)樣品在兩個(gè)生物學(xué)獨(dú)立的重復(fù)樣本上重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
圖2. 人類精子不包含傳統(tǒng)的TAD結(jié)構(gòu)
3、TAD邊界的建立
TAD結(jié)構(gòu)在人類2細(xì)胞胚胎中并不明顯。但是，兩細(xì)胞胚胎中的某些區(qū)域顯示出絕緣子結(jié)合的跡象，可以分隔上游和下游相互作用。在胚胎后期，這些區(qū)域大部分成為TAD邊界（圖3a）; 這些區(qū)域因此可以被視為未成熟的TAD邊界。在這項(xiàng)研究中，本研究將未成熟的TAD邊界和成熟的TAD邊界都定義為絕緣邊界。然后，本研究分析了人類胚胎發(fā)育過程中絕緣邊界的動(dòng)力學(xué)。本研究的數(shù)據(jù)表明，分別在2細(xì)胞，8細(xì)胞，morula 和胚泡階段分別形成635、905、317和306個(gè)絕緣邊界（圖3a）。本研究還在小鼠2細(xì)胞胚胎中發(fā)現(xiàn)了未成熟的TAD邊界，并確定了小鼠階段獲得的絕緣邊界。比較了人類樣品中2細(xì)胞階段的絕緣邊界與胚泡階段的總邊界，結(jié)果表明2細(xì)胞邊界與胚泡邊界的30％重疊（圖3b）。本研究的數(shù)據(jù)還顯示ZGA階段包含胚泡中67％的邊界，這與小鼠模型中的比例相似（圖3b）。此外，當(dāng)將ZGA階段的人類邊界與小鼠的邊界進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在明顯的重疊（圖3c）。例如，本研究在人和小鼠的ZGA階段發(fā)現(xiàn)了TTC1和CCNG1基因周圍的絕緣邊界。
接下來，作者試圖確定在早期階段優(yōu)先形成絕緣邊界的基因組區(qū)域。在2細(xì)胞階段首先獲得邊界的基因組區(qū)域與持家基因的距離小于在后期階段獲得邊界的邊界區(qū)域的距離（圖3d）。在小鼠胚胎中觀察到了類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，在較早階段獲得的絕緣邊界往往位于人和小鼠的看家基因周圍。作者還發(fā)現(xiàn)邊界附近的管家基因的表達(dá)水平傾向于高于其他管家基因的表達(dá)水平。
據(jù)報(bào)道，重復(fù)元素與細(xì)胞系中的TAD邊界相關(guān)。因此，作者分析了胚胎中特定于階段獲得的邊界周圍重復(fù)元件的富集。作者的數(shù)據(jù)表明，在人類早期階段，Alu重復(fù)序列（而不是LINE或MIR重復(fù)序列）（圖3e）富集在絕緣邊界周圍。在小鼠胚胎中觀察到了相似的結(jié)果。例如，在人類或小鼠RAB5A基因周圍的2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界被建立在Alu密集區(qū)。此外，作者的數(shù)據(jù)表明AluS元素在2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界周圍高度富集（圖3e）。此外，與其他階段相比，在2細(xì)胞階段獲得的絕緣邊界周圍的AluS重復(fù)序列在裂解階段得到了高度表達(dá)?？傮w而言，這些結(jié)果表明，人類胚胎中絕緣的邊界傾向定位在Alu密集區(qū)周圍。
圖a 絕緣得分的熱圖，以在特定階段（±1 Mb范圍）獲得的絕緣邊界為中心。n，特定階段獲得的絕緣邊界的數(shù)量；b，絕緣邊界中心。
圖b 相對(duì)于胚泡邊界數(shù)，每個(gè)階段中絕緣邊界數(shù)的累積百分比。
圖c 維恩圖，顯示人ZGA邊界和小鼠ZGA邊界之間的重疊（χ2檢驗(yàn)）。
圖d 累積分布函數(shù)圖，用于特定階段獲得的邊界與人類胚胎中最接近的管家基因的距離（來自2-3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的合并數(shù)據(jù)）。虛線表示200 kb的距離。P = 3.24×10?8（2單元vs 8單元階段）; P = 9.95×10-8（2細(xì)胞期與桑ula鼠比較）; P = 3.83×10-11（2細(xì)胞期vs胚泡）;雙面Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。
圖e 在人類胚胎的特定階段獲得的絕緣邊界處AluS元素的富集。
圖3. 在人類胚胎發(fā)育過程中建立絕緣邊界
4、TAD的建立依賴于ZGA以及CTCF調(diào)控染色體
先前的報(bào)道表明，TAD的建立獨(dú)立于小鼠和果蠅胚胎中的ZGA。作者調(diào)查了這些特征在人類中是否保守。作者用α-amanitin處理人合子以抑制ZGA，并在8細(xì)胞階段收集了胚胎。令人驚訝的是，在經(jīng)過α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中，TAD的結(jié)構(gòu)模糊不清（圖4a）。用α-amanitin處理的胚胎中TAD信號(hào)的相對(duì)方差也顯著低于未處理的8細(xì)胞胚胎（圖4b）。因此，在人類胚胎中建立TAD需要ZGA。
接下來，作者旨在鑒定ZGA期間參與TAD建立的蛋白質(zhì)。粘著蛋白復(fù)合物和CTCF在高階染色體結(jié)構(gòu)中具有重要作用。因此，作者研究了這些蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。粘附蛋白復(fù)合物的亞基，例如RAD21，已經(jīng)在ZGA之前在人類胚胎中高度表達(dá)。相比之下，當(dāng)在人類胚胎中首次觀察到TAD結(jié)構(gòu)時(shí)，CTCF的表達(dá)在ZGA階段之前非常有限，并且在8細(xì)胞階段急劇增加（圖4c）。在經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中，CTCF表達(dá)受到抑制。一致地，免疫染色圖像顯示在2細(xì)胞核中幾乎未觀察到CTCF蛋白（圖4d）。CTCF明顯存在于未經(jīng)處理的8細(xì)胞核中，但在經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞核中卻不存在（圖4d）。這些結(jié)果表明CTCF表達(dá)需要人ZGA。
接下來，作者研究了在人類胚胎中建立TAD對(duì)CTCF的需求。作者通過將CTCF siRNA（siCTCF）注入人受精卵來抑制CTCF的表達(dá)，并在morula期收集胚胎（圖4d）。值得注意的是，在siCTCF morula中幾乎沒有觀察到三角形TAD結(jié)構(gòu)（圖4e）。相對(duì)的TAD信號(hào)方差支持抑制siCTCF morula中TAD的建立。一致地，大多數(shù)TAD邊界在對(duì)照morula中消失，而在siCTCF morula中變?nèi)酢Ｒ虼?，本研究的?shù)據(jù)表明ZGA期間CTCF表達(dá)是人類胚胎中TAD建立所必需的。
圖a 人8細(xì)胞和經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎中的相互作用熱圖。
圖b 人2細(xì)胞（n = 3），8細(xì)胞（n = 3）和經(jīng)α-amanitin處理的8細(xì)胞胚胎（n = 3）中TAD信號(hào)相對(duì)方差的箱形圖。方框顯示第25、50和75個(gè)百分位，胡須顯示1.5倍的四分位間距。***對(duì)于8細(xì)胞和α-amanitin處理過的8細(xì)胞之間的所有成對(duì)比較，校正后的P <0.001（帶有Benjamini-Hochberg多重檢驗(yàn)校正的雙面Wilcoxon秩和檢驗(yàn)）。
圖c 人類胚胎發(fā)育過程中CTCF表達(dá)的動(dòng)態(tài)（來自參考文獻(xiàn)22的表達(dá)數(shù)據(jù)；每個(gè)階段3至20個(gè)細(xì)胞）。數(shù)據(jù)為平均值±s.e.m。RPKM，每百萬個(gè)映射讀操作的每千個(gè)轉(zhuǎn)錄本的讀操作數(shù)。
圖d CTCF在人類胚胎中的免疫熒光（n = 2-3）。比例尺40μm。
圖e 跟蹤未處理的對(duì)照morula和siCTCF morula中的TAD結(jié)構(gòu)，其中覆蓋了基因表達(dá)。
圖4. CTCF調(diào)控人類胚胎中染色質(zhì)的建立
總結(jié)
盡管人類和小鼠胚胎都顯示出高階染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的全基因組重編程，但人類和小鼠胚胎之間的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)存在很大差異。本研究的數(shù)據(jù)為哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的建立提供了寶貴的資源和機(jī)制的見解。
文獻(xiàn)下載：
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31801998
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文獻(xiàn)套路之Hi-C和ATAC-seq聯(lián)合發(fā)NC
]]>目前Hi-C?技術(shù)主要的應(yīng)用方向是輔助基因組組裝和染色質(zhì)互作。輔助基因組組裝：在已有二代或三代組裝的Draft genome序列和已知染色體數(shù)目的前提下，利用Hi-C測(cè)序數(shù)據(jù)將Draft genome序列進(jìn)行染色體群組的劃分，并確定各序列在染色體上的順序和方向，使基因組組裝組裝水平提升到染色體水平。染色質(zhì)互作：利用Hi-C技術(shù)揭示基因組的一般結(jié)構(gòu)特征，包括從隔室（A/B Compartments）到拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（TAD）,最后再到環(huán)（loop）的染色質(zhì)層級(jí)結(jié)構(gòu)；還可以與ATAC-seq、ChIP-seq、DNase-seq和RNA-seq等數(shù)據(jù)進(jìn)行多組學(xué)分析揭示基因組三維結(jié)構(gòu)與表觀遺傳修飾、基因密度和轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系。
說到Hi-C輔助基因組組裝，百邁客還真是碩果累累呢！2018年就有三篇Nature Genetics和一篇Giga Science見刊，2019年才過去短短兩個(gè)多月，就已經(jīng)有2篇Molecular Plant見刊了，這成果真是可喜可賀??！
下面就聽小編娓娓道來吧~~
百邁客成功案例一：二倍體亞洲棉Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Sequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits.
中文題目：以更新的亞洲棉A基因組為基礎(chǔ)的243份二倍體棉花的重要農(nóng)藝性狀的研究
發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表時(shí)間：2018年5月
合作單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
研究方法：基因組、遺傳進(jìn)化和全基因組關(guān)聯(lián)分析等
研究背景
材料選擇
基因組測(cè)序材料：二倍體G. arboreum栽培品種cultivar Shixiya1（SXY1）；
自然群體材料選擇：243份棉花，包含230份亞洲棉G. arboretum和13份草棉G. herbaceum?[243份棉花選自國家種質(zhì)基因庫（中國安陽），種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（ICR，CAAS）的溫室中]，插入片段長(zhǎng)度500 bp；測(cè)序深度6X；
遺傳群體材料選擇：親本（GA0146和GA0149），測(cè)序深度20X；2個(gè)混池（F2群體，有絨型和無絨型各20個(gè)子代），測(cè)序深度30X；
主要研究結(jié)果
1、亞洲棉基因組組裝更新
利用三代測(cè)序儀PacBio平臺(tái)共獲得142.54Gb的原始數(shù)據(jù)，組裝1.71Gb亞洲棉基因組，Contig N50=1.1 Mb，最長(zhǎng)的Contig為12.37 Mb。利用Hi-C技術(shù)獲得超過20×的reads，將組裝的1573Mb的數(shù)據(jù)定位到13條染色體上，與已經(jīng)發(fā)表的基因組相比，當(dāng)Hi-C數(shù)據(jù)比對(duì)到更新的基因組后，對(duì)角線外的不一致性明顯減少（見圖1a和b）。
圖1，Hi-C數(shù)據(jù)在兩版亞洲棉基因組上的比對(duì)
注：a. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉原基因組比對(duì)；b. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉更新基因組比對(duì)
2、二倍體棉花群體遺傳進(jìn)化分析
共計(jì)選擇了243份二倍體棉花材料：230份亞洲棉G. arboreum?(A2)?和13份草棉G. herbaceum?(A1)，來自于中國南部(SC)，長(zhǎng)江(YZR)和黃河（YER）。以雷蒙德氏棉（G. raimondii）為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，G. herbaceum（草棉）和G. arboretum（亞洲棉）聚類成2個(gè)獨(dú)立的群（見圖2a和b）。G. arboretum（亞洲棉）進(jìn)一步又分為SC，YZR和YER三個(gè)群，顯示了地理分布模式的差異，進(jìn)而利用PCA分析支持這一結(jié)果（見圖2c）。
圖2 二倍體棉花的群體分層分析
注：a，243份二倍體棉花系統(tǒng)發(fā)育樹；b，243份二倍體棉花的群體結(jié)構(gòu)分析c，PCA主成分分析（中國亞洲棉的PCA分析；亞洲棉和草棉的PCA分析）
3、選擇性清除分析與GWAS分析
人工選擇在農(nóng)作物的馴化和遷徙的過程中具有重要的作用。群體結(jié)構(gòu)分析顯示當(dāng)K=4時(shí)，YER與SC和YZR明顯不同（圖2b，K=4）。通過兩兩群體間的選擇性清除分析（FST）鑒定出了分別覆蓋到59，53和51個(gè)顯著遺傳分化的區(qū)域。SC和YZR之間的21個(gè)分化的區(qū)域（約43.5 Mb?含有915個(gè)基因）在群體SC和YER之間是保守的（圖3a）。對(duì)來自不同環(huán)境下的11個(gè)重要性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在98個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)中，其中25信號(hào)個(gè)來自基因區(qū)（外顯子或內(nèi)含子區(qū)），包含與形態(tài)性狀相關(guān)的8個(gè)信號(hào)區(qū)，與產(chǎn)量性狀相關(guān)的6個(gè)信號(hào)區(qū)，與油籽性狀相關(guān)的3個(gè)信號(hào)區(qū)；剩余73個(gè)信號(hào)來自非編碼區(qū)。大部分農(nóng)藝性狀的GWAS關(guān)聯(lián)信號(hào)中顯示地理差異，如分支數(shù)，開花期，鈴重和抗病性這些性狀定位在保守的基因區(qū)（圖4b）。
參考文獻(xiàn)：Du X, Huang G, He S, et al. Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits[J]. Nature genetics, 2018, 50(6): 796.
百邁客成功案例二：異源四倍體陸地棉和海島棉Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons?Gossypium hirsutum?and?Gossypium barbadense.
中文題目：兩個(gè)異源四倍體陸地棉和海島棉基因組破譯
發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表時(shí)間：2018年12月
合作單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
研究方法：基因組、比較基因組分析、遺傳圖譜構(gòu)建及QTL定位等
研究背景
棉花是世界上最大的天然紡織纖維來源，每年纖維產(chǎn)量的90％以上來自異源四倍體棉花（G. hirsutum和G. barbadense），它起源于大約1-2百萬年前的異源多樣化事件，隨后是數(shù)千年的不對(duì)稱亞基因組選擇。陸地棉（G. hirsutum）由于其高產(chǎn)而在全世界種植。G. barbadense以其卓越的纖維質(zhì)量而受贊譽(yù)。為了培育產(chǎn)生纖維更長(zhǎng)，更細(xì)和更強(qiáng)韌的陸地棉（G. hirsutum）品種，一種合理有效的方法是將海島棉（G. barbadense）的優(yōu)良纖維性狀引入陸地棉。基因組學(xué)啟動(dòng)的育種策略需要對(duì)基因組組織進(jìn)行詳細(xì)而有力的理解。
材料選擇
測(cè)序策略：PacBio RS II、BioNano和Illumina HiSeq
分析軟件：
基因組組裝：Canu (version 1.3)?，BLASR (version 1.3.1)?，BWA (version 0.7.10-r789)?，Pilon(version 1.22)?；光學(xué)圖譜糾錯(cuò)：核酸內(nèi)切酶Nt.BssSI23，AutoDetect，IrysSolve；Hi-C染色體掛載：核酸內(nèi)切酶HindIII，BWA（version 0.7.10-r789），LACHESIS，HiC-Pro；基因組完整性評(píng)估：BUSCO評(píng)估；TE注釋：PASTEClassifier (version 1.0)；RepeatMasker (version 4.0.6)；基因預(yù)測(cè)和注釋：Genscan，Augustus (version 2.4)，GlimmerHMM (version 3.0.4)，GeneID (version 1.4)和SNAP (version 2006-07-28)；GeMoMa (version 1.3.1)；假基因組預(yù)測(cè)：GenBlastA (version 1.0.4)，GeneWise (version 2.4.1)；
著絲粒區(qū)域鑒定：blastn，SPSS software (version 17.0)?；基因組共線性分析：MUMmer (version 3.23)，GATK(version 3.1.1)，Samtools(version 0.1.19)?，MCScanX package；結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)：MUMmer3 (version 3.23)；二倍體棉重測(cè)序SNPs鑒定：Trimmomatic (version 0.32)，BWA；包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體SNPs鑒定：BWA，GATK和Samtools；CSSLs群體QTLs定位與表達(dá)分析：QTL IciMapping (version 4.0)?；TopHat2 (version 2.0.13)?；Cufflinks (version 2.2.1)；STRUCTURE (version 2.3)?；TASSEL software (version 5.0)?；
主要研究結(jié)果
1、陸地棉Gossypium hirsutum和海島棉Gossypium barbadense基因組組裝及注釋
???本研究利用PacBio RSII、BioNano和Hi-C技術(shù)組裝出了高質(zhì)量的異源四倍體陸地棉G. hirsutum?acc. TM-1和海島棉G. barbadense?acc. 3-79基因組，最終組裝出26條染色體。在陸地棉和海島棉中分別預(yù)測(cè)到70,199和71,297個(gè)基因，PacBio數(shù)據(jù)分析顯示，在全基因組范圍內(nèi)陸地棉6mA甲基化占所有腺嘌呤的0.21%，海島棉占0.22%。且6mA甲基化修飾在每條染色體上是均勻分布的，而5mC修飾在染色體臂中分布較少（見圖1）。
圖1 陸地棉和海島棉染色體特征（含表觀遺傳標(biāo)記）
?2、陸地棉和海島棉染色體結(jié)構(gòu)變異分析
高質(zhì)量的參考基因組使研究人員直接通過比較基因組就能鑒定大的結(jié)構(gòu)變異成為可能。發(fā)現(xiàn)有170.2 Mb的基因組序列被鑒定為G. hirsutum和G. barbadense之間的倒位，包括120.4 Mb的At亞基因組和49.8 Mb的Dt在A06染色體中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)大的倒位變異，包括3個(gè)染色體臂內(nèi)倒位（in1, in3 and in4）和1個(gè)染色體臂間倒位（in2），通過Hi-C數(shù)據(jù)在斷點(diǎn)周圍離散的染色質(zhì)相互作用（圖2a），突出了Hi-C技術(shù)識(shí)別大規(guī)模染色體重排的優(yōu)勢(shì)。光學(xué)圖（BioNano optical maps）譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了這些反轉(zhuǎn)斷裂位點(diǎn)（圖2b）。
圖2，陸地棉和海島棉A06染色體倒位鑒定
注：a，Hi-C互作熱圖；b，光學(xué)圖譜鑒定
3、漸滲系的構(gòu)建及QTLs定位
由陸地棉Emian22作為受體親本，海島棉3-79作為供體親本構(gòu)建包含168個(gè)個(gè)體的CSSLs群體，旨在引入有利的變異，如纖維質(zhì)量。QTL定位分析，共鑒定到5個(gè)性狀的13個(gè)QTLs位點(diǎn)，其中控制纖維長(zhǎng)度位點(diǎn)2個(gè)，控制纖維強(qiáng)度位點(diǎn)4個(gè)，馬克隆值位點(diǎn)2個(gè)，纖維伸長(zhǎng)率位點(diǎn)2個(gè)，纖維均勻度位點(diǎn)3個(gè)（圖3）。在這些QTLs位點(diǎn)中，9個(gè)位點(diǎn)之前未被鑒定出，通過檢驗(yàn)13個(gè)QTLs中的基因表達(dá)水平，研究人員檢測(cè)到了235個(gè)在纖維發(fā)育過程中高度表達(dá)的基因，同時(shí)還整合了基因組變異數(shù)據(jù)來預(yù)測(cè)候選基因，而這些基因值得進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位以確認(rèn)對(duì)這些性狀具有重要影響的基因。
圖4，QTL定位結(jié)果展示
注：a，陸地棉纖維質(zhì)量相關(guān)QTLs分布（紅框）；b，纖維長(zhǎng)度相關(guān)QTL定位；c，纖維伸長(zhǎng)率相關(guān)QTL定位
參考文獻(xiàn)：Wang M, Tu L, Yuan D, et al. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons, Gossypium hirsutum and Gossypium barbadense[J]. Nature genetics, 2019, 51(2): 224.
英文題目：Allele-defined genome of the autopolyploid?sugarcane Saccharum spontaneum L.
中文題目：同源多倍體（Saccharum spontaneum L.）基因組等位基因鑒定
發(fā)表期刊：Nature Genetics
發(fā)表時(shí)間：2018年10月
合作單位：福建農(nóng)林大學(xué)基因組與生物技術(shù)研究中心
研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進(jìn)化等
研究背景
栽培甘蔗（Saccharum?spp., Poaceae）相比其它主要作物與眾不同，因?yàn)樗嵌啾扼w種間雜種，具有極其復(fù)雜的基因組。目前甘蔗是世界上收獲量最大的第一作物和第五價(jià)值作物（FAO, 2012），甘蔗種植在90多個(gè)國家的約2600萬公頃土地上，每年收獲18.3億公噸，總產(chǎn)值接近570億美元，提供80％的糖和40％的乙醇，作為主要的糖和生物燃料原料作物。雖然現(xiàn)代甘蔗栽培種的高含糖量來源于栽培種“S. officinarum”，但是它們的耐寒性，抗病性和再生能力更多的來自于與含糖量低的親本“S. spontaneum”的回交中。Saccharum officinarum品種（2n= 8x=80），在莖中積累蔗糖達(dá)到干重的50％，但是易受生物和非生物脅迫的影響。自然狀態(tài)記錄下染色體數(shù)目最少的S. spontaneum種質(zhì)（2n = 5x =?40）已經(jīng)不存在了，然而，由另一種八倍體SES208單倍化形成的S.spontaneum“AP85-441”（1n = 4x = 32）為甘蔗染色體的原型的組裝提供了基礎(chǔ)。本研究闡釋了最重要，復(fù)雜基因組的基因組作物S. spontaneum遺傳藍(lán)圖和進(jìn)化歷史。
材料選擇
S. spontaneum?AP85-441用于基因組測(cè)序；64份世界種質(zhì)資源庫材料進(jìn)行重測(cè)序；
測(cè)序策略：IlluminaHiSeq 2500和PacbioRSII
分析軟件：
基因組組裝：BAC文庫測(cè)序數(shù)據(jù)初步組裝（組裝軟件：ALLPATH-LG,SPAdes和SOAPdenovo2，保留組裝結(jié)果）；PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)糾錯(cuò)組裝（CANUv1.5）；Hi-C染色體分群（ALLHIC）。
基因注釋：重復(fù)序列預(yù)測(cè)（RepeatModeler），TE轉(zhuǎn)座子序列鑒定（RepeatMaskerversion 4.05；TEclassversion 2.1.3），串聯(lián)重復(fù)序列分析（TRFpackageversion 4.07）；基因注釋（MAKER，JBrowse，Trinity，PASA，SNAP，GENEMARK，AUGUSTUS等）；注釋完整性評(píng)估（BUSCOversion 3）；
等位基因變異及優(yōu)勢(shì)表達(dá)分析：單倍體基因組構(gòu)建（nucmer，MUMmerpackage，Assemblytics）；等位基因鑒定（MCScanX，GMAP）；等位基因變異分析（nucmer，Assemblytics）；等位基因的優(yōu)勢(shì)表達(dá)（Trimmomatic，HiSAT2)。
重測(cè)序群體結(jié)構(gòu)分析：序列比對(duì)與變異檢測(cè)（Bowtie2，SAMtools，BWA，GATK，SnpEffv3.6c)；基因組遺傳多樣性評(píng)估（π，Tajima’sD）；PCA分析（VCFtools，PLINK）；系統(tǒng)發(fā)育分析（ML trees，PHYLIP package）；群體結(jié)構(gòu)分析（Admixture，STRUCTURE）；基因組重排區(qū)遺傳多樣性與不同多倍體種質(zhì)的基因組遺傳多樣性分析（π，SNP density，Tajima’sD）。
主要研究結(jié)果
1、基因組測(cè)序組裝
本研究中利用Illumina、PacBio和Hi-C技術(shù)，加之本研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)的算法ALLHIC成功的將甘蔗基因組組裝到染色體水平，最終組裝出32條染色體，錨定了2.9 Gb基因組，涵蓋了97%的基因含量。進(jìn)一步利用998,370 SNPs的高密度遺傳圖譜來驗(yàn)證Hi-C組裝的結(jié)果，在兩種方法中，89%的contigs的順序是一致的。32條染色體中包含了8個(gè)同源組群和4組單倍型A，B，C和D（見圖1）。
圖1?S. spontaneum?AP85-441染色體與高粱染色體的比對(duì)
2、基礎(chǔ)染色體數(shù)目的減少
AP85-441基因組的組裝顯示了S. spontaneum的染色體數(shù)目從10降到8，而這與頻繁復(fù)制的古復(fù)制染色體對(duì)相關(guān)，通過與高粱的聚類比對(duì)，發(fā)現(xiàn)高粱祖先5號(hào)染色體和8號(hào)染色體同源物經(jīng)歷了染色體裂變（見圖2）。SbChr05（A12）的祖先染色體斷裂分為兩個(gè)主要部分，即C5S（A12S）和C5L（A12L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr06（A2）和SbChr07（A5）的祖先染色體；SbChr8（A11）的祖先染色體斷裂為兩個(gè)主要的部分，即C8S（A11S）和C8L（A11L），分別轉(zhuǎn)移到SbChr09（A6）和SbChr02（A7 + A9）的祖先染色體中。SbChr8和SsChr5之間及SbChr5和SsChr7之間近乎同源的短片段是在高粱與甘蔗分化前，高粱SSA形成于13.4 MYA同源基因的殘留物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，S5中較小的SSA區(qū)域和S8中SSA的較大區(qū)域在重排的AP85-441基因組中也是保守的。
圖2 禾本科染色體數(shù)進(jìn)化（高粱n = 10到甘蔗n = 8）
3、S. spontaneum的起源與遺傳多樣性分析
研究中對(duì)世界種質(zhì)資源庫的64份S. spontaneum材料進(jìn)行重測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其核苷酸多態(tài)性（π）[0.00021±0.000002 ]遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它克隆繁殖的作物，如馬鈴薯，木薯，葡萄和柑。通過PCA主成分分析及群體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)64份材料分為3個(gè)群，這些群體也受到自然和地理起源推斷的64份種質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的支持（見圖3），group1來源于菲律賓，印度尼西亞和巴布亞新幾內(nèi)亞；group2和group3來源于印度，巴基斯坦和伊朗。基因組倍性在三組中差異很大（從6x-16x）。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，表明不同的倍性可能是從祖先獨(dú)立進(jìn)化而來的。
圖3 64份甘蔗的群體結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系分析
參考文獻(xiàn)：Zhang J, Zhang X, Tang H, et al. Allele-defined genome of the autopolyploid sugarcane Saccharum spontaneum L[J]. Nature genetics, 2018, 50(11): 1565.
百邁客成功案例四：異源四倍體野生花生Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Genome of an allotetraploid wild peanut?Arachis monticola: a de novo assemble.
中文題目：異源四倍體野生花生（Arachis monticola）基因組組裝
發(fā)表期刊：Giga Science
發(fā)表時(shí)間：2018年6月
合作單位：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
研究方法：基因組
研究背景
花生作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是提供重要的蛋白和油料的基礎(chǔ)。作為豆科的重要分支之一，花生屬一共包括30個(gè)二倍體品種，1個(gè)異源四倍體野生花生(A.monticola)和1個(gè)異源四倍體栽培花生(A.hypogaea)(2n = 4x = 40)。作為栽培花生農(nóng)藝性狀改良的重要野生資源供體，野生四倍體花生的基因組也一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。成功破譯四倍體野生花生的基因組有助于科學(xué)家和育種專家對(duì)A.hypogaea起源及馴化過程的理解。
材料選擇
野生四倍體花生A.monticola；
測(cè)序策略：Illumina X-ten、PacbioRSII和Bionano
分析軟件：
基因組組裝：Canu v1.5，WTDBG，Pilon（v1.22），LoRDEC v0.5，F(xiàn)alcon v0.7，quickmerge v0.2，Allpath-LG v1.4，IrysView v2.5.1等；Hi-C染色體掛載：HiC-Pro，LACHESIS，Pbjerlly2，GapCloser，Pilon；基因組質(zhì)量評(píng)估：BUSCO pipeline v3.0.2?等。
主要研究結(jié)果
在這項(xiàng)研究中，研究人員以野生四倍體花生A.monticola為研究材料，進(jìn)行測(cè)序得到36X SMRT subreads + 76X HiC data + 210X Bionano Irys data + 50XIllumina reads的測(cè)序數(shù)據(jù)，整合多種組裝工具的優(yōu)勢(shì)，最終獲得了參考基因組水平的高質(zhì)量組裝結(jié)果。又利用BioNano和Hi-C等方法對(duì)基因組進(jìn)行區(qū)分最終A.monticola得到的subgenome與祖先A基因組A.duranensis、祖先B基因組A.ipaensis之間的比較。并利用Hi-C數(shù)據(jù)對(duì)獲得的基因組進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)估（見圖1）。
圖1 四倍體野生花生及兩個(gè)二倍體祖先熱圖評(píng)估
參考文獻(xiàn)：Yin D, Ji C, Ma X, et al. Genome of an allotetraploid wild peanut Arachis monticola: a de novo assembly[J]. GigaScience, 2018, 7(6): giy066.
百邁客成功案例五：雜草稻Hi-C輔助基因組組裝
英文題目：Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game.
中文題目：群體基因組分析結(jié)合從頭組裝揭示雜草稻作為進(jìn)化演繹的起源
發(fā)表期刊：Molecular Plant
發(fā)表時(shí)間：2019年1月
合作單位：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
研究方法：基因組、比較基因組、群體遺傳進(jìn)化
研究背景
材料選擇
測(cè)序策略：Illumina Hiseq和PacBio
分析軟件：
303份水稻樣本的SLAF-seq結(jié)果SNP鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：SOAP，MEGA 7.0；遺傳多樣性分析：BioPerl；QTL定位：利用親本W(wǎng)R04-6和Qishanzhan構(gòu)建F8RIL群體，包含168個(gè)子代，通過SLAF-seq技術(shù)HighMap軟件構(gòu)建遺傳圖譜和QTL定位；群體進(jìn)化推演分析：DIYABC v. 2.0.3
基因組組裝：Canu，WTDBG，Pilon（v1.22），bwa；Hi-C染色體掛載：bwa，LACHESIS，Pbjerlly2；重復(fù)注釋：LTR-FINDER v1.05，MITE-Hunter，Repeat Scout v1.0.5，PILER-DF v2.4，PASTEClassifier，RepeatMasker v4.0.6；蛋白編碼基因預(yù)測(cè)及評(píng)估：Genscan，Augustus v2.4，GlimmerHMM v3.0.4，GeneID v1.4，SNAP（version 2006-07-28），GeMoMa v1.3.1，PASA v2.0.2，EVM v1.1.1；非編碼RNA預(yù)測(cè)：tRNAscan-SE v1.3.1；假基因預(yù)測(cè)：GenBlastA v1.0.4，GeneWise v2.4.1；基因功能和motif注釋：BLAST v2.2.31，BLAST2GO，InterProScan；結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)：MUMmer4；共線性分析：MCScanX；選擇壓力分析：PAML v4；
主要研究結(jié)果
本研究利用來自中國和日本的48份WRAH種系，43份與WRAH共存的溫帶粳稻品種（Japonica-C），26份中國溫帶粳稻品種（Japonica-L），四個(gè)典型的栽培稻亞群（12tropical?japonica，145?indica/xian,，11?aus和?3?aromatic），15份來自中國南方中緯度雜草稻（WRSC）以及已經(jīng)發(fā)表了全基因組SNP信息的30份野生祖先種，基于SLAF-seq共檢測(cè)到122,777個(gè)高質(zhì)量SNP，叫做122k-SNP，用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（見圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，WRAH在系統(tǒng)發(fā)育上不同于Japonica-C，并且與溫帶粳稻Japonica-L群體形成了明確分群；WRSC種質(zhì)與秈稻種質(zhì)劃分到一個(gè)亞群。
圖1 系統(tǒng)發(fā)育樹分析
2、基因組測(cè)序、組裝及注釋
本研究基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）、高通量NGS和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（Hi-C）技術(shù)組裝了高質(zhì)量的亞洲高緯度雜草稻W(wǎng)R04-6基因組。最終組裝出染色體水平的高質(zhì)量基因組，包含12條染色體，大小為373.93Gb，contigN50位6.09Mb。最后，去除重復(fù)序列后通過從頭預(yù)測(cè)、同源預(yù)測(cè)和RNA-seq分析共獲得41,385個(gè)基因，有96.32%的基因在NR，KOG,，GO，KEGG，TrEMBL數(shù)據(jù)庫中得到了注釋（見圖3）。
圖3 Hi-C輔助基因組組裝熱圖
圖4 雜草稻基因組分布圖
3、比較基因組分析
利用OrthoMCL軟件檢測(cè)WR04-6、R498、Nipponbare和W1943（O. rufipogon）間核心的、非必須的和共有的基因家族。在WR04-6中鑒定到了909個(gè)擴(kuò)張的基因家族，并且通過通路分析顯示，這些基因在光合作用和呼吸作用中顯著富集（p<0.01），例如氧化磷酸化、光合作用和核糖體的KEGG途徑，考慮其可以作為遺傳改良的信號(hào)。以O. barthii作為外群構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示W(wǎng)R04-6與粳稻祖先的分化時(shí)間估計(jì)在3,706ya（1,235ya-6,326ya），見圖4。
圖4 以O(shè). barthii作為外群構(gòu)建的最大似然樹
參考文獻(xiàn)：Sun J, Ma D, Tang L, et al. Population Genomic Analysis and De novo Assembly Reveal the Origin of Weedy Rice as an Evolutionary Game[J]. Molecular plant, 2019.
英文題目：A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Reveals the Genetic Basis of Its Forage and Papermaking Usage.
中文題目：染色體水平的基因組揭示構(gòu)樹飼用和造紙的遺傳基礎(chǔ)
發(fā)表期刊：Molecular Plant
發(fā)表時(shí)間：2019年2月
合作單位：中國科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
研究方法：基因組、比較基因組等
研究背景
構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera，2n=2x=26）屬于桑科（Moraceae）構(gòu)屬（Broussonetia）多年生喬木，是我國鄉(xiāng)土樹種和先鋒植物，有悠久的歷史和文化，因?yàn)椴虃愑盟旒埗澜缏劽?gòu)樹的樹皮和樹干是造紙的優(yōu)質(zhì)原料，樹葉還可以作為蛋白飼料，其根、莖、葉、果實(shí)及種子均可入藥，富含黃酮類化合物；還是尾礦處理、生態(tài)綠化的理想樹種。然而，有關(guān)構(gòu)樹的研究主要集中于造紙、藥理藥化、養(yǎng)殖以及生態(tài)綠化等應(yīng)用方面，基礎(chǔ)生物學(xué)的研究很少。因此，構(gòu)樹栽培改良的第一步是獲得其遺傳背景，以便能更好地掌握其特有特征的生物學(xué)機(jī)制。
材料選擇
生長(zhǎng)5年的雌性構(gòu)樹用于基因組測(cè)序；基因組測(cè)序的雌性構(gòu)樹與未知雄性構(gòu)樹雜交，獲得包含120個(gè)F1個(gè)體的CP群體用于構(gòu)建遺傳圖譜輔助基因組組裝。
測(cè)序策略：Illumina Hiseq和PacBio
分析軟件：
基因組組裝注釋：基因組組裝：?ALLPATHS-LG，SSPACE，GapCloser，BioNano Genomics?，RefAligner，LoRDEC，Pbjelly，MAPS，ALLMAPS；Hi-C輔助基因組組裝：Hi-C-Pro，LACHESIS；基因組注釋：RepeatMasker (version open-4.0.5)，PILER (version 1.0)，RepeatScout (version 1.0.5)，LTR-finder，MITE，PASTEClassifer，PASA，AUGUSTUS（vertion 3.0.3），SNAP，GlimmerHMM，GeneID，Genescan (version 1.1.0)，），Genewise (version 2.2.0），TopHat2 (version 2.0.7)，Cufflinks (version 2.2.1)，GeneMarkS-T (version 5.1)，?Genewise；基因功能注釋，InterProScan (version 5)，Hmmscan (HMMER, version 3.0)，BLAST2GO (version 2.5)，BLASTP，Trembl，tRNAscan-SE (version 1.3.1)，Infernal cmscan (version 1.1.1)。
比較基因組分析：直系同源基因鑒定：?OrthoMCL (version 2.0)；系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與分化時(shí)間估算：?MUSCLE、Gblocks (version 0.91b)和RaxML（version 8），MCMCTREE評(píng)估分化時(shí)間；基因家族擴(kuò)張和收縮分析：CAFE（vertion 3.1）；染色體共線性分析、4DTV檢測(cè)及Ks值計(jì)算：MCscan。
主要研究結(jié)果
1、基因組組裝與注釋
本研究使用Illumina HiSeq和PacBio Sequel測(cè)序平臺(tái)，用Hi-C、光學(xué)（BioNano Irys）和遺傳圖譜輔助，進(jìn)行雌性構(gòu)樹的基因組組裝。獲得染色體水平的高質(zhì)量構(gòu)樹基因組，其大小為386.93Mb，scaffold N50是29.48Mb，有99.25%（357.56Mb）的基因組被錨定在13條染色體上，Hi-C熱圖評(píng)估（見圖1）。一共預(yù)測(cè)了30,512個(gè)基因，98.09%與已知基因同源并且得到了功能上的注釋。
圖1 熱圖驗(yàn)證Hi-C輔助染色體組裝
??圖2 構(gòu)樹染色體分布圖
2、構(gòu)樹的基因組進(jìn)化
利用14個(gè)物種（無油樟、亞麻、毛楊、棉花、擬南芥、黃瓜、苜蓿、桑樹、構(gòu)樹、桃樹、葡萄、番茄、毛竹和玉米）的單拷貝直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)構(gòu)樹與桑樹在同一分支，在大約3100萬年前與桑樹分開，與桃子的分化時(shí)間在大約7800萬年前（見圖3），該結(jié)果被4DTv的分析結(jié)果所證實(shí)，通過Ks分析進(jìn)一步得到證實(shí)。
圖3 14個(gè)物種的系統(tǒng)發(fā)育樹
根據(jù)已報(bào)道的雙子葉植物祖先和譜系特異性WGD，本研究推測(cè)，古六倍化始祖的21條染色體至少經(jīng)歷了11次大的染色體融和（cfus）和2次染色體裂變后產(chǎn)生了?？浦虚g狀態(tài)的12條始祖染色體（見圖4）。?？频氖甲嫒旧w的數(shù)目與葫蘆科和楊柳科是相似的，但是與薔薇科（n = 9）、豆科（n = 6）、錦葵科（n = 16）和茄科（n = 16）是不同的。進(jìn)化推演分析表明，構(gòu)樹的染色體是從?？频?2條始祖染色體經(jīng)27次融合和28次裂變重構(gòu)的，說明構(gòu)樹基因組在進(jìn)化過程中至少經(jīng)歷了68次的染色體融合和裂變。
圖4 構(gòu)樹和其他6種植物基因組重構(gòu)的進(jìn)化推演
3、比較基因組分析
在構(gòu)樹基因組中共發(fā)現(xiàn)15,254個(gè)基因家族，與桑樹分化之后，有431個(gè)基因家族擴(kuò)張，230個(gè)基因家族收縮，表明在適應(yīng)進(jìn)化過程中，構(gòu)樹中更多的基因家族經(jīng)歷了擴(kuò)張而不是收縮。另外，與苜蓿、毛楊和甜橙相比，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生明顯收縮（58個(gè)家族共1,342個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，占蛋白編碼基因的4.4%）。肌動(dòng)蛋白在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育的很多層面扮演著重要的角色，在酵母和很多動(dòng)物中，肌動(dòng)蛋白僅被一個(gè)單基因編碼。在構(gòu)樹中僅發(fā)現(xiàn)4個(gè)肌動(dòng)蛋白，少于藻類、小立碗蘚和無油樟。
參考文獻(xiàn)：Peng X, Liu H, Chen P, et al. A Chromosome-Scale Genome Assembly of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) Provides New Insights into Its Forage and Papermaking Usage[J].?Molecular plant, 2019.
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影響因子：8.827
文章題目：The Tartary Buckwheat Genome Provides Insights into Rutin Biosynthesis and Abiotic Stress Tolerance
摘要概述
A high-quality, chromosome-scale Tartary buckwheat genome sequence of 489.3 Mb is assembled. A new buckwheat lineage-specific whole genome duplication is discovered. The reference genome facilitated the identification of many new genes predicted to be involved in rutin biosynthesis and regulation,aluminum stress resistance, and in drought and cold stress responses.
研究背景
苦蕎也叫苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）是蓼科蕎麥屬作物，雖然我們習(xí)慣認(rèn)為它屬于麥類，但其實(shí)他并非禾本科而是蓼科。苦蕎性喜陰濕冷涼，多種植于高山地域，一般垂直分布為海拔1200～3500m。所以苦蕎具有很高的抗逆性，尤其是在抗寒和抗干旱方面?？嗍w是藥食兩用的作物，苦蕎麥性味苦、平、寒, 有益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣寬腸健胃的作用。能降血壓、降血糖、降血脂, 改善微循環(huán)等作用, 又稱“三降”食品。其主要藥用成分為蘆丁，該文章也對(duì)蘆丁的生物合成進(jìn)行了研究。
測(cè)序材料
韃靼蕎麥（Fagopyrum tataricum cv. Pinku1），2n=2X=16；
測(cè)序方法
Illumina、BioNano、PacBio、Hi-C、fosmid
研究?jī)?nèi)容
1.基因組組裝和注釋
苦蕎通過K-mer預(yù)估基因組大小約為489Mb，流式細(xì)胞儀預(yù)估為540Mb。共組裝出來489.3Mb的基因組序列，共8778個(gè)Contigs，Contig N50=550.7kb。通過Hi-C數(shù)據(jù)將436.4Mb的序列錨定到8條染色體上（定位比例為89.18%）。然后再通過光學(xué)圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。三代數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性通過二代評(píng)估為99.96%，并且在基因區(qū)具有更少的錯(cuò)誤存在。
共預(yù)測(cè)得到33366個(gè)基因，平均每100Kb具有6.8個(gè)基因。非編碼RNA注釋結(jié)果為278 miRNAs, 1,395 tRNAs, 455 rRNAs, and 518 snRNAs。通過注釋已組裝基因組的50.96%為重復(fù)序列，其中LTR的比例占全基因組的38.64，包含Gypsy (30.52%) 和 Copia (5.48%)。
圖1 苦蕎基因組circle圖
2.系統(tǒng)發(fā)育和全基因組復(fù)制事件分析
苦蕎與擬南芥、可可、大豆、葡萄、楊樹、馬鈴薯、番茄以及單子葉的水稻和玉米構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，見下圖。此外還進(jìn)行基因家族聚類分析，找出共同和特有的基因家族。
圖2 苦蕎系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹
通過苦蕎與擬南芥、苦蕎與甜菜進(jìn)行分析，通過Ks計(jì)算發(fā)現(xiàn)苦蕎經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件，近期是在下圖0.84-0.92之間，而更古老的一次復(fù)制發(fā)現(xiàn)在64.42~70.77 Mya。而全基因組復(fù)制事件的發(fā)生，也導(dǎo)致了很多與抗逆相關(guān)基因家族的擴(kuò)張或者保留。這也與后期苦蕎的抗逆性有一定關(guān)系。
圖3 苦蕎全基因組復(fù)制事件
3.參與蘆丁合成基因的鑒定
蘆丁的生物合成具有特殊的意義，而苦蕎被認(rèn)為是這種有益的類黃酮的主要食物來源?？喔墒w麥營養(yǎng)生物質(zhì)中含有3%的蘆丁。通過比較基因組以及不同生長(zhǎng)部位的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)原來所不知道的全長(zhǎng)蛋白CHI(FtPinG0002790600)和f3h(FtPinG0006662600)。
圖4 蘆丁生物合成途徑的研究
4.苦蕎抗逆性研究
該研究還發(fā)現(xiàn)苦蕎中存在大量與植物耐鋁、抗旱和耐寒相關(guān)的新基因，其中產(chǎn)物包括一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。
小編總結(jié)
本文研究了苦蕎的基因組測(cè)序，除了三代測(cè)序還通過光學(xué)圖譜和Hi-C技術(shù)進(jìn)一步提升基因組的組裝質(zhì)量。通過比較基因組學(xué)研究明確了苦蕎的系統(tǒng)發(fā)育地位，以及通過全基因組復(fù)制事件的研究發(fā)現(xiàn)了抗逆基因的擴(kuò)張和保留。其中結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)μJ丁的生物合成途徑進(jìn)行了研究。
該研究由山西農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所喬治軍研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所梁承志研究員團(tuán)隊(duì)及華南農(nóng)農(nóng)業(yè)大學(xué)王俊教授團(tuán)隊(duì)共同完成，其中百邁客只參與了其中部分研究，再次祝賀各位老師取得好的成績(jī)。
參考文獻(xiàn)
The Tartary buckwheat genome provides insights into rutin biosynthesis and abiotic stress tolerance.
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