1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動(dòng)物類(lèi)組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱(chēng)、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿(mǎn)足建庫(kù)測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)等

1.2提取風(fēng)險(xiǎn)提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿(mǎn)足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿(mǎn)足提取一次的量，如樣品經(jīng)過(guò)特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量

2.1常規(guī)植物組織送樣要求

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類(lèi)核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類(lèi)型

2)如果您開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類(lèi)送樣量要求

1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過(guò)柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按照送樣建議來(lái)送樣

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)植物類(lèi)樣本（不含藻類(lèi)）制備流程

由于老葉或其它組織DNA&RNA含量可能較低，而次生代謝物含量一般相對(duì)較高，因此，為降低DNA&RNA提取難度并減少污染物干擾，請(qǐng)盡量選擇健康、幼嫩的葉片組織；不建議選擇易帶有寄生或共生生物的組織，以及不易清洗和研磨的根、莖等組織致密的器官。另外藻類(lèi)組織中的水分會(huì)影響提取得率，取樣時(shí)需將組織樣中的水分吸干。建議在采集樣本之前，將樣本置于黑暗環(huán)境24-48小時(shí)后再制備樣本（停止光合作用，減少代謝干擾），新鮮組織樣采樣流程如下：

1)用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干，再?gòu)闹参矬w上取下新鮮組織（注：如果是需要進(jìn)行處理，請(qǐng)?jiān)诨铙w上進(jìn)行處理后再取樣

2)如果組織體積較大，將組織剪切成 50-100 mg小塊,約黃豆大小的小塊,放入提前準(zhǔn)備好的凍存管中

3)處理好的組織樣本混合均勻后立即保存于提前標(biāo)記編號(hào)、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管

4)液氮凍存前將樣品分割成 50~100 mg 左右的小塊，處理好的組織樣本混合均勻后保存于提前標(biāo)記編號(hào)、液氮預(yù)冷的2 mL 或更大體積的旋蓋凍存管中，根據(jù)組織樣本量選擇核酸凍存管

5)迅速置于液氮中冷凍 1~2 h，然后按照順序依次放入樣品盒中（不建議自封袋送樣），轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存（禁止亂放，尤其是項(xiàng)目中樣品個(gè)數(shù)較多時(shí)），干冰運(yùn)輸

注：植物組織不建議使用組織保護(hù)液保存。對(duì)于一些需要?jiǎng)內(nèi)シN皮處理的，因樣品速凍后無(wú)法準(zhǔn)確剔除，如有需要?jiǎng)內(nèi)シN皮的老師須自行操作

4.2Ultra Long ONT類(lèi)植物樣本

4.2.1植物組織選取及取樣步驟

1)準(zhǔn)備剪刀、鑷子、錫箔紙，選取新鮮幼嫩的組織， 例如幼嫩的葉片（也可以是新長(zhǎng)出的幼嫩根尖）

2)除去枯萎的，損傷的部分，除去莖，葉柄和粗的葉脈

3)將組織清理干凈，可放在容器中用水沖洗，除去雜質(zhì)和其他殘余碎片

4)將清洗干凈的樣本倒在吸水紙上，再蓋上一張吸水紙用手輕輕壓幾次（注意不要太用力損傷 葉片），水盡可能除去

5)將葉片稱(chēng)量一下，每0.5g/管（推薦使用 50ml 離心管）裝好，標(biāo)注樣本名稱(chēng)，日期，準(zhǔn)確重量

6)放入液氮快速冷凍 10min，轉(zhuǎn)入-80 °C 冰箱保存，干冰運(yùn)輸

7)葉片剪下后的稱(chēng)量等操作，請(qǐng)?jiān)?10min 內(nèi)完成，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致葉片失水不可用，部分地區(qū)氣溫較高失水更快，操作時(shí)間需更短

4.2.2注意事項(xiàng)與說(shuō)明

1)葉片要幼嫩的、新鮮的 、完整的（不要有損傷），可用手對(duì)比老葉和嫩葉的觸感，嫩葉的觸感非常柔軟

2)林木 、灌木類(lèi)的請(qǐng)根據(jù)生長(zhǎng)周期來(lái)確定采樣時(shí)間， 最好是發(fā)芽后長(zhǎng)出來(lái)的嫩葉

3)禾本科黃化苗 1-2 周，最好有專(zhuān)門(mén)的黃化經(jīng)驗(yàn)，黃化太過(guò)會(huì)造成細(xì)胞核難提取 。如果不會(huì)黃化就送 1-2 周剛長(zhǎng)出來(lái)的葉片，具體生長(zhǎng)時(shí)間需根據(jù)植物的生長(zhǎng)狀態(tài)判斷

4)組培苗，不建議直接使用，盡量移植到土壤中培育出植株，取新長(zhǎng)出的幼嫩葉片，若使用組培苗送樣，請(qǐng)客戶(hù)多準(zhǔn)備備份樣本

5)送樣前請(qǐng)拍照記錄樣品狀態(tài)

5、注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開(kāi)始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過(guò)少或過(guò)多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過(guò)多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長(zhǎng)旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒(méi)有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過(guò)短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類(lèi)樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開(kāi)離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類(lèi)組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過(guò)凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒(méi)有專(zhuān)業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性

9)長(zhǎng)年保存的組織：保存時(shí)間超過(guò)一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以?shī)A帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法精確取樣，無(wú)法稱(chēng)重。組織量過(guò)多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取

11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見(jiàn)的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過(guò)特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)

6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)

6.1樣本總量不足、濃度過(guò)低存在風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差

6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫(kù)片段異常

6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問(wèn)題質(zhì)量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫(kù)失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫(kù)隨機(jī)性差等問(wèn)題

3)文庫(kù)構(gòu)建失敗

4)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標(biāo)RNA含量低

1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫(kù)失敗

2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫(kù)失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高

1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動(dòng)物類(lèi)組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱(chēng)、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿(mǎn)足建庫(kù)測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)等

1.2提取風(fēng)險(xiǎn)提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿(mǎn)足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注1：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿(mǎn)足提取一次的量，如樣品經(jīng)過(guò)特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量

注2：由于骨骼含有大量鈣鹽和礦物質(zhì)，細(xì)胞密度低，核酸含量較少；毛發(fā)暴露在外界環(huán)境，容易受到紫外線、溫度變化、微生物影響，導(dǎo)致核酸降解，毛干核酸含量低，毛囊周?chē)?xì)胞多難獲取，為了保證您實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，這兩個(gè)部位不建議送組織樣，建議自行提取

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類(lèi)核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類(lèi)型

2)如果您開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類(lèi)送樣量要求

1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過(guò)柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按照送樣建議來(lái)送樣。

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)動(dòng)物類(lèi)樣本

送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫(kù)，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對(duì)較高的組織，樣本制備優(yōu)先級(jí)：血液>內(nèi)臟>肌肉?；铙w取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類(lèi)型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周?chē)哪[瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以?xún)?nèi)）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)

6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

7)干冰運(yùn)輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞和研磨后的組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過(guò)量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長(zhǎng)寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過(guò)夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過(guò)夜（使Solution充分浸潤(rùn)組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

3)RNAlater? Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來(lái)的保存液中繼續(xù)保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來(lái)講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長(zhǎng)期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

注：如果組織較小，建議優(yōu)先選擇此方式送樣

4.2全血

DNA類(lèi)產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類(lèi)產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿。

4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

注1：血液采集管請(qǐng)盡量不要用需專(zhuān)門(mén)對(duì)應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無(wú)對(duì)應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開(kāi)節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)人員手中不可超過(guò) 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動(dòng)物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

3)魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)、兩棲類(lèi)全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

4)做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物優(yōu)先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測(cè)試中，采集全血是第一步。 這類(lèi)測(cè)試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時(shí)內(nèi)迅速降解。 此外，通過(guò)基因誘導(dǎo)過(guò)程，某些種類(lèi)的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對(duì)數(shù)量估計(jì)過(guò)低或過(guò)高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過(guò)減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時(shí)，PAXgene 血液 RNA 管可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)和定量

2)采集前準(zhǔn)備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專(zhuān)用RNA穩(wěn)定劑）

B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無(wú)菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識(shí)別標(biāo)簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過(guò)程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲(chǔ) PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時(shí)，最多 72 小時(shí)，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲(chǔ)溫度，請(qǐng)參見(jiàn)“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息

4)注意事項(xiàng)

A.確保采血管在有效期內(nèi)，無(wú)漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預(yù)先打開(kāi)管蓋，避免穩(wěn)定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)按照處理玻璃管的方式來(lái)處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會(huì)導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯(cuò)誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯(cuò)誤或產(chǎn)品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

4.3細(xì)胞

4.3.1貼壁細(xì)胞

4.3.1.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.3.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細(xì)胞溶解物的黏度來(lái)判斷。在細(xì)胞剛?cè)芙鈺r(shí)，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會(huì)消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過(guò)少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加裂解液。裂解液加入量過(guò)少，會(huì)導(dǎo)致抽提的 RNA 降解

4.3.2懸浮細(xì)胞

4.3.2.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.3.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

5、注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取

1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開(kāi)始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過(guò)少或過(guò)多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過(guò)多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長(zhǎng)旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒(méi)有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過(guò)短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類(lèi)樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開(kāi)離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類(lèi)組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過(guò)凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒(méi)有專(zhuān)業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性

9)長(zhǎng)年保存的組織：保存時(shí)間超過(guò)一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以?shī)A帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法精確取樣，無(wú)法稱(chēng)重。組織量過(guò)多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取

11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見(jiàn)的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過(guò)特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)

6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)

6.1樣本總量不足、濃度過(guò)低存在風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差

6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫(kù)片段異常

6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問(wèn)題質(zhì)量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫(kù)失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫(kù)隨機(jī)性差等問(wèn)題

3)文庫(kù)構(gòu)建失敗

4)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標(biāo)RNA含量低

1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫(kù)失敗

2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫(kù)失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高

1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動(dòng)物類(lèi)組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。信息單中樣本名稱(chēng)、組織部位必須與實(shí)物相符，避免因信息單與實(shí)物不符導(dǎo)致反復(fù)核對(duì)，影響樣本質(zhì)量、錄入周期，導(dǎo)致提取核酸質(zhì)量不滿(mǎn)足建庫(kù)測(cè)序要求，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)等

1.2聲明

對(duì)于危害程度為第一、二類(lèi)的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織樣。對(duì)于危害程度為三、四類(lèi)的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過(guò)銷(xiāo)售或運(yùn)營(yíng)與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)負(fù)責(zé)人溝通，確認(rèn)無(wú)高致病和傳染性且能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)后再安排樣品寄送。危害程度的判定標(biāo)準(zhǔn)具體參見(jiàn)《人間傳染的病原微生物名錄》

1.3提取風(fēng)險(xiǎn)提示

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關(guān)，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣的要求更高。組織提取時(shí)可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿(mǎn)足質(zhì)量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對(duì)較高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)老師務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。對(duì)于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請(qǐng)單獨(dú)溝通。送樣量結(jié)果展示為滿(mǎn)足提取一次的量，如樣品經(jīng)過(guò)特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實(shí)驗(yàn)可以順利進(jìn)行，請(qǐng)酌情增加送樣量

2.1常規(guī)動(dòng)物類(lèi)組織送樣要求

2.2動(dòng)物類(lèi)血液送樣量

2.3動(dòng)物類(lèi)細(xì)胞送樣量

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，DNA類(lèi)核酸可提供以下檢測(cè)手段中的一種或多種檢測(cè)結(jié)果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時(shí)請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)募兓椒?，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶?duì)DNA樣品的污染，并詳細(xì)注明溶解DNA所使用的溶解液類(lèi)型

2)如果您開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為miRNA的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，并且提供的是總RNA的樣本，請(qǐng)務(wù)必確認(rèn)您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號(hào)備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類(lèi)送樣量要求

1)針對(duì)核酸有雜質(zhì)、污染、粘稠、顏色等情況，需要過(guò)柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運(yùn)輸中會(huì)有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質(zhì)、顏色等物質(zhì)導(dǎo)致會(huì)產(chǎn)生大量損失的風(fēng)險(xiǎn)，為保證樣本一次檢測(cè)合格并節(jié)約寶貴的重送樣時(shí)間，送樣建議量是高于公司判定標(biāo)準(zhǔn)的，請(qǐng)?jiān)诤怂崃孔銐虻那疤嵯卤M量按

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)動(dòng)物類(lèi)樣本（脊柱動(dòng)物、哺乳動(dòng)物）

常規(guī)動(dòng)物主要包括脊椎動(dòng)物組織樣本主要包括：哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)、爬行動(dòng)物以及兩棲動(dòng)物。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫(kù)，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對(duì)較高的組織，樣本制備優(yōu)先級(jí)：血液>內(nèi)臟>肌肉?；铙w取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細(xì)胞的病變組織），立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類(lèi)型。對(duì)腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周?chē)恼＝M織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周?chē)哪[瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產(chǎn)品適用）

1)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以?xún)?nèi)）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號(hào)

6)立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

7)干冰運(yùn)輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細(xì)胞組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請(qǐng)務(wù)必先進(jìn)行液氮研磨破碎，樣品量取參考標(biāo)準(zhǔn)送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過(guò)量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時(shí)選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長(zhǎng)寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過(guò)夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過(guò)夜（使Solution充分浸潤(rùn)組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

3)RNAlater? Solution 不會(huì)影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實(shí)驗(yàn)所需的用量，把剩余的組織再放入到原來(lái)的保存液中繼續(xù)保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時(shí)，樣本不會(huì)結(jié)凍，但可能會(huì)有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時(shí)，樣本會(huì)結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來(lái)講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個(gè)月，-20 °C 或-80 °C 可長(zhǎng)期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長(zhǎng)期保存

4.2全血

DNA類(lèi)產(chǎn)品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類(lèi)產(chǎn)品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。血液相關(guān)產(chǎn)品僅接收全血或分離的細(xì)胞樣本，不接收血清、血漿

4.2.1DNA常規(guī)產(chǎn)品制備操作流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

注1：血液采集管請(qǐng)盡量不要用需專(zhuān)門(mén)對(duì)應(yīng)提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無(wú)對(duì)應(yīng)試劑盒影響提取時(shí)間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運(yùn)輸需避開(kāi)節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)人員手中不可超過(guò) 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動(dòng)物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

3)魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)、兩棲類(lèi)全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實(shí)際情況送樣）

4)做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產(chǎn)品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物優(yōu)先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細(xì)胞內(nèi) RNA 使用的許多分子測(cè)試中，采集全血是第一步。 這類(lèi)測(cè)試中的最大挑戰(zhàn)是細(xì)胞內(nèi) RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時(shí)內(nèi)迅速降解。 此外，通過(guò)基因誘導(dǎo)過(guò)程，某些種類(lèi)的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導(dǎo)均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄物相對(duì)數(shù)量估計(jì)過(guò)低或過(guò)高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過(guò)減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導(dǎo)，可穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時(shí)，PAXgene 血液 RNA 管可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的基因轉(zhuǎn)錄物檢測(cè)和定量

2)采集前準(zhǔn)備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專(zhuān)用RNA穩(wěn)定劑）

B.符合標(biāo)準(zhǔn)的靜脈采血裝置（無(wú)菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護(hù)裝備（手套、護(hù)目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標(biāo)本識(shí)別標(biāo)簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應(yīng)當(dāng)先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過(guò)程中使用的采血裝置的內(nèi)部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機(jī)構(gòu)推薦的標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺技術(shù)程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲(chǔ) PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時(shí)，最多 72 小時(shí)，然后再處理或轉(zhuǎn)移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲(chǔ)溫度，請(qǐng)參見(jiàn)“PAXgene 血液RNA 管內(nèi)所采集標(biāo)本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細(xì)信息

4)注意事項(xiàng)

A.確保采血管在有效期內(nèi)，無(wú)漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預(yù)先打開(kāi)管蓋，避免穩(wěn)定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運(yùn)輸期間破裂的風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)按照處理玻璃管的方式來(lái)處理冷凍的試管。使用者必須確認(rèn)自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運(yùn)輸協(xié)議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會(huì)導(dǎo)致血液與附加劑的比率錯(cuò)誤，且可能導(dǎo)致分析結(jié)果錯(cuò)誤或產(chǎn)品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會(huì)影響實(shí)驗(yàn)所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過(guò)EP管的一半），轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長(zhǎng)期保存（實(shí)際根據(jù)采血管的說(shuō)明要求操作）

3)干冰運(yùn)輸

4.3昆蟲(chóng)

1)昆蟲(chóng)樣本，需進(jìn)行表面微生物的清洗，某些吸血性昆蟲(chóng)，例如蚊子，血吸蟲(chóng)，該類(lèi)型樣本可能存在外源污染，需要進(jìn)行切腹，去除腸道處理。較大個(gè)體的選取不帶腸道部分的組織，將組織切成長(zhǎng)寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大小），對(duì)于較小個(gè)體只能用整個(gè)個(gè)體的，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)酿囸I處理（注意保證昆蟲(chóng)的活性）

2)提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個(gè)以?xún)?nèi)）

3)轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

注1：小型昆蟲(chóng)組織務(wù)必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時(shí)該類(lèi)樣本因只滿(mǎn)足一次或低于常規(guī)一次提取用量，我們無(wú)法保證100%提取合格

注2：蜜蜂送樣時(shí)盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個(gè)蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。不建議送實(shí)驗(yàn)室剔除，因?yàn)榻M織速凍過(guò)之后再剔除會(huì)化凍，提取降解的可能性較大

4.4微生物

4.4.1細(xì)菌

1)顯微鏡下觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，建議收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌

2)將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無(wú)菌，無(wú)核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min

3)棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸

5)以下為不規(guī)范送樣圖片：菌體平板（左圖），菌液送樣（右圖）

4.4.2真菌

4.4.2.1單細(xì)胞真菌

單細(xì)胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應(yīng)所需酵母菌的量需≤1×107個(gè)，以 5×106-1× 107個(gè)為宜。您要做的項(xiàng)目要求送樣量較大時(shí)，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨(dú)保存

1)顯微鏡下觀察酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)，最好收集生長(zhǎng)期處于對(duì)數(shù)期的酵母菌

2)將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無(wú)菌，無(wú)核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min

3)棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時(shí)間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長(zhǎng)期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸

4.4.2.2多細(xì)胞真菌（大型真菌）

1)取完整菌體，先用大量清水沖洗其表面雜質(zhì)，再用純水清洗一遍，使用吸水紙吸干表面的水份后，用剪刀將組織分割為小塊，做好標(biāo)記（樣本名稱(chēng)，日期,，體 積）放液氮里速凍，干冰寄送

2)菌絲：將無(wú)菌棉簽輕輕觸碰菌落或菌斑的中心部分，避免碰到邊緣或其他細(xì)菌來(lái)源。然后，將棉簽迅速劃過(guò)培養(yǎng)基表面，以收集菌絲轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無(wú)菌，無(wú)核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。(可根據(jù)樣品量收集多管或使用15mL螺旋管收集）

4.5水產(chǎn)類(lèi)

水產(chǎn)類(lèi)包括淡水魚(yú)類(lèi)、海水魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、藻類(lèi)。送樣需要選擇新鮮采集的樣本

1)優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時(shí)應(yīng)選取核酸含量較多的部位

2)取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體

3)活體取材后用預(yù)冷的0.9%生理鹽水進(jìn)行清洗，去除血漬和污物

4)將樣品分割成50 mg左右的小塊（約黃豆大?。?，樣品分割和處理時(shí)應(yīng)盡量在冰上進(jìn)行，防止樣品降解。避免裝樣太滿(mǎn)以至凍裂，造成樣品污染

注：水產(chǎn)類(lèi)樣品需盡量保證為新鮮個(gè)體。盡量避免寄送保存時(shí)間較長(zhǎng)或經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融的組織樣品。針對(duì)軟體動(dòng)物可先使用75%的乙醇進(jìn)行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運(yùn)輸；針對(duì)刺胞動(dòng)物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取

4.6細(xì)胞

4.6.1貼壁細(xì)胞

4.6.1.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.6.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.6.2懸浮細(xì)胞

4.6.2.1液氮速凍法

1)確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶(hù)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過(guò)實(shí)而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速800g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

4.6.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個(gè)細(xì)胞加 1 mL TRIzol

2)細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時(shí)選擇干冰運(yùn)輸寄送

5、注意事項(xiàng)

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實(shí)驗(yàn)器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長(zhǎng)提取對(duì)樣本的質(zhì)量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質(zhì)量的核酸，請(qǐng)務(wù)必按照送樣手冊(cè)所規(guī)定的準(zhǔn)備樣本。對(duì)珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。

1)組織速凍時(shí)間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開(kāi)始降解，尤其是 RNA，故采集時(shí)，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內(nèi)完成，越快越好。速凍時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致速凍不徹底，核酸有降解風(fēng)險(xiǎn)

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如動(dòng)物皮膚、毛發(fā)等。請(qǐng)嚴(yán)格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過(guò)少或過(guò)多均不利于提取實(shí)驗(yàn)。采樣量較少會(huì)導(dǎo)致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過(guò)多反而會(huì)造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險(xiǎn)

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長(zhǎng)旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒(méi)有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時(shí)間過(guò)短都有一定幾率導(dǎo)致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運(yùn)輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導(dǎo)致核酸的降解。除RNA類(lèi)樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產(chǎn)品均建議送速凍組織，不建議使用保護(hù)液送樣，化開(kāi)離心會(huì)有幾率導(dǎo)致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類(lèi)組織不建議送樣。請(qǐng)各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過(guò)凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒(méi)有專(zhuān)業(yè)的保護(hù)劑，去除不凈一起速凍送樣會(huì)影響組織的完整性

9)長(zhǎng)年保存的組織：保存時(shí)間超過(guò)一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以?shī)A帶有正常組織，提取實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法精確取樣，無(wú)法稱(chēng)重。組織量過(guò)多的不能全部取樣，只隨機(jī)選取適量組織提取

11)對(duì)于同一個(gè)組織樣品需要同時(shí)提取 DNA和 RNA 的，請(qǐng)務(wù)必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對(duì)樣本的核酸質(zhì)量會(huì)造成不同程度的影響，常見(jiàn)的會(huì)導(dǎo)致核酸 的降解或者得率降低。因此，經(jīng)過(guò)特殊處理的樣本，在送樣時(shí)，務(wù)必請(qǐng)?jiān)跇颖拘畔沃羞M(jìn)行詳細(xì)的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費(fèi)

6、不合格樣品存在風(fēng)險(xiǎn)

6.1樣本總量不足、濃度過(guò)低存在風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

6.2降解樣本風(fēng)險(xiǎn)

1)文庫(kù)構(gòu)建失敗

2)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

3)導(dǎo)致數(shù)據(jù)隨機(jī)性異常

4)數(shù)據(jù)質(zhì)量差

5)導(dǎo)致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機(jī)性差

6)導(dǎo)致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫(kù)片段異常

6.3蛋白或其他雜質(zhì)污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準(zhǔn)，影響問(wèn)題質(zhì)量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導(dǎo)致建庫(kù)失敗，或即使達(dá)到上機(jī)要求也可能導(dǎo)致文庫(kù)隨機(jī)性差等問(wèn)題

3)文庫(kù)構(gòu)建失敗

4)文庫(kù)產(chǎn)量低不能上機(jī)測(cè)序或測(cè)序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標(biāo)RNA含量低

1)總RNA達(dá)到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導(dǎo)致建庫(kù)失敗

2)總RNA達(dá)到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導(dǎo)致建庫(kù)失敗或者測(cè)序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高

一、百邁客Hi-C取樣要求

1、基本要求

1.1安全

1)人身安全：現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下（采取一定防護(hù)后），樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)人員本身無(wú)傷害

2)環(huán)境安全：樣品對(duì)室內(nèi)、室外環(huán)境無(wú)影響（以免因?yàn)椴恍⌒膶?dǎo)致一些活體樣本進(jìn)入外界 環(huán)境造成不良影響）

1.2無(wú)污染

1)植物樣本不得有其它植物的污染，不得有病害，不得有蟲(chóng)害（尤其是一些肉眼不容易發(fā) 現(xiàn)的蟲(chóng)卵等）

2)全血樣品不得引入取血物種本身攜帶的病菌、病毒等潛在污染

1.3依據(jù)“理論”&“實(shí)踐”

1)“理論”：基于各種實(shí)驗(yàn)原理的理論依據(jù)

2)“實(shí)踐”：基于 BMK 本身積累的多物種、多樣品的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

1.4送樣說(shuō)明

1)客戶(hù)或銷(xiāo)售人員應(yīng)將樣本的信息詳細(xì)說(shuō)明，所有樣品必須標(biāo)注好關(guān)鍵樣品信息：如物種名 稱(chēng)、樣品名稱(chēng)、到樣日期、是否需要返樣等

2)樣品信息單必須早于或與樣品同時(shí)到達(dá)公司，一則方便樣品中心錄樣，二則方便項(xiàng)目盡快 啟動(dòng)

3)因?yàn)闃悠肥状稳硬蛔恪①|(zhì)量不好或信息單未及時(shí)到位造成項(xiàng)目進(jìn)度延后時(shí)需要由客戶(hù)或 銷(xiāo)售部承擔(dān)相關(guān)責(zé)任（特殊項(xiàng)目除外）

4)因公司內(nèi)部培養(yǎng)條件不能同時(shí)滿(mǎn)足各種物種的生長(zhǎng)需求，因此，送達(dá)活體樣品應(yīng)該盡量是 送到即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的樣品（量足，質(zhì)好），不建議在公司保存過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，防止培養(yǎng)樣本死亡

5)所有需要特殊關(guān)注的樣品，在華開(kāi)任務(wù)單中需要備注相關(guān)信息，并提前郵件通知 Hi-C 相關(guān) 注意事項(xiàng)；特殊物種需要書(shū)面告知材料培養(yǎng)條件（光、溫度、水、肥 or 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物等等）

6)生長(zhǎng)狀態(tài)趨于不好的樣品，或一些離體枝條需要提前與實(shí)驗(yàn)溝通，保證到樣后可及時(shí)處理 樣品

1.5法定節(jié)假日期間和周末送樣要求

1)節(jié)假日當(dāng)天及假日前后各一周不建議再到樣， 如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實(shí)驗(yàn)平臺(tái)溝通送樣需求

2)周末休息日2 天不建議到樣，如遇特殊情況需要節(jié)前一周與實(shí)驗(yàn)平臺(tái)溝通送樣需求

2、動(dòng)物樣本-全血

2.1新鮮血液

血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后立即送樣，并盡量確 保 24h 內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室

2.2凍存血液

血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不 建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，室溫正立放置，平衡 2 h 后直接液氮速凍，干冰 運(yùn)輸

2.3血液需求量

每一個(gè)樣品，建議送樣 1~2 mL

2.4全血取樣注意事項(xiàng)（防止污染、溶血）

1)取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液 樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染

2)準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）

3)依據(jù)抗凝管的實(shí)際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL 規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL

4) 取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻

5)天氣較熱時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)使用冰袋低溫運(yùn)輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)無(wú)需加冰袋 運(yùn)輸

3、動(dòng)物樣本-組織標(biāo)本

3.1凍存樣品取樣要求

1)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時(shí)間不要太長(zhǎng)（以?xún)龃鏁r(shí)間 1 個(gè)月為宜）

2)應(yīng)將肌肉表面附著的血液、脂肪、毛皮等非肌肉組織處理干凈

3)直接液氮速凍干冰運(yùn)輸

3.2凍存組織樣品理論用量

組織量 2 g 為佳，最少 1 g；1 g 可滿(mǎn)足 3 個(gè)文庫(kù)構(gòu)建，最低要求至少 0.2 g

4、動(dòng)物樣本-細(xì)胞

4.1取樣要求

需要進(jìn)行甲醛交聯(lián)固定后送樣

4.2細(xì)胞樣品量要求

一般來(lái)講 2*10^6個(gè)細(xì)胞滿(mǎn)足一個(gè) Hi-C 文庫(kù)，建議培養(yǎng)到 107 個(gè)細(xì)胞用于固定，以保證 試驗(yàn)的可重復(fù)性， 由于細(xì)胞的數(shù)量可能會(huì)影響 Hi-C 試驗(yàn)的質(zhì)量，因此需要細(xì)胞數(shù)目盡量精確

4.3交聯(lián)細(xì)胞

1) 取 10^7 個(gè)新鮮活細(xì)胞置于 15 mL 離心管中，加入 10 mL 的 cold 1×PBS 搖勻，1000 g， 4℃離心 2 min

2)吸棄上清，每管再次加入 10 mL 的 cold 1×PBS 輕混勻，1000g ，4℃離心 2 min

3)吸棄上清，用 10 mL cold 1 × PBS 重懸沉淀，加入適量（570 μL）37%甲醛（終濃度 2%）混勻，室溫放置 10 min(1-2 min 混勻一次)；（注意甲醛需要使用 sigma 等進(jìn)口品 牌，以免影響固定效果，也可以由當(dāng)?shù)劁N(xiāo)售申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)室寄送固定試劑）

4)加適量（710 μL）2 M 的甘氨酸（常溫保存）終止反應(yīng)（終濃度 0.125 M），室溫混勻5min，冰上放置15min

5)固定好的細(xì)胞 600 g 4℃ 離心 8 min ，棄上清

6)1 mL cold PBS 重懸沉淀，600g 4℃ 離心 8 min ，去上清

7)液氮速凍干冰運(yùn)輸或-80℃保存

注：做到此步直接液氮速凍，干冰運(yùn)輸，信息單中備注：“細(xì)胞交聯(lián)完成”

5、真菌樣本

5.1凍存樣品—“慢凍快融”或“直接速凍 ”

1) 應(yīng)保證菌體為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，保存時(shí)間不要太長(zhǎng)（以?xún)龃鏁r(shí)間 1 個(gè)月為宜）

2)直接液氮速凍干冰運(yùn)輸

5.2組織樣品理論用量

組織量 1 g 為佳，最少 0.2 g

6、植物樣本

6.1活體植株

1)幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗、組培苗——全部葉片、部分幼嫩莖

2)成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2 片幼嫩葉片

3)取樣量：保證每一個(gè)庫(kù)的理論用量 1g

4)其它：特殊貴重活體樣品需要客戶(hù)提供樣品的種植、保存條件，以保證樣品的正常生長(zhǎng)

6.2離體枝條

1)枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉（到樣后會(huì)選擇葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）；枝條中下端保留部分成熟葉片

2)枝條預(yù)處理：剪斷枝條， 自底端往上約 5 cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋， 袋中 噴水，填充部分空氣，密封袋口

3)枝條運(yùn)輸： 自封袋放入泡沫箱，箱體內(nèi)側(cè)壁放部分冰袋（保證低溫運(yùn)輸），冰袋與自封袋 間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導(dǎo)致樣品被凍傷

4)運(yùn)輸時(shí)間：保證 24h內(nèi)到樣，最多不得超過(guò) 3天

5)取樣量：保證每一個(gè)庫(kù)的理論用量1g

6)其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項(xiàng)目，如野外采樣、植株過(guò)大等導(dǎo)致的取樣或運(yùn)輸比較困難的項(xiàng)目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實(shí)驗(yàn)；離體枝條如果保存、運(yùn)輸不善會(huì)存在部分潛在風(fēng)險(xiǎn)：即得到的實(shí)驗(yàn)效果可能會(huì)比活體植株檢測(cè)結(jié)果 稍差（理論上的潛在風(fēng)險(xiǎn)）

6.3凍存植物組織

6.3.1凍存組織風(fēng)險(xiǎn)

1)植物組織液氮速凍后容易造成破碎，導(dǎo)致后續(xù)固定等操作無(wú)法有效實(shí)施

2)植物組織破碎嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)核甚至染色體造成物理機(jī)械損傷

6.3.2取樣要求

1)從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干

2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片

3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于 2mL或更大體積的旋蓋凍存管中，每份植物> 1 g，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱(chēng)

4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存

5)為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣品備份 1-2 份，植物> 1 g/份，以防部分樣品降解重新取材、制備或送樣

6)應(yīng)保證組織樣品新鮮凍存，保存時(shí)間不要太長(zhǎng)（以?xún)龃鏁r(shí)間 1 個(gè)月為宜）

7)運(yùn)送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸

6.4其他植物樣本

1)非葉片（活體植株）：有常規(guī)提取經(jīng)驗(yàn)，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位

2)非葉片（離體植株）：處理與運(yùn)輸與離體枝條相同，有常規(guī)提取經(jīng)驗(yàn)，須為 DNA 提取率高、黏度低的部位

3)取樣量：保證每一個(gè)庫(kù)的理論用量 1 g

4)非葉片樣品適用于葉片難提取的植株或老師的特殊要求，此類(lèi)樣品DNA提取失敗的風(fēng)險(xiǎn)高于葉片樣本，需要銷(xiāo)售與老師交代清楚

6.5植物取樣注意事項(xiàng)

1)建議一次送樣量在 1~4g

2)所有待取的幼嫩組織長(zhǎng)勢(shì)必須正常（無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)營(yíng)養(yǎng)缺失）

3)對(duì)于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時(shí)不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第1-2 片嫩葉

4)因?yàn)橥ǔＢ阕又参锉缺蛔又参锔y選擇適合的解離液，裸子植物的葉子大多為針形、 線形、鱗形，葉片表面有較厚的角質(zhì)層，細(xì)胞內(nèi)次生代謝物多，這對(duì)提取完整的細(xì)胞核極為不利，因此，選取

萌發(fā)的新鮮幼苗作為材料會(huì)更合適

5)客戶(hù)沒(méi)有條件寄送活體植物樣本時(shí)，可以選擇自己固定，由當(dāng)?shù)劁N(xiāo)售像實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)寄送固定試劑 ( β-巰基乙醇需要老師自己準(zhǔn)備）

7、Hi-C交聯(lián)流程

1)配制NIBuffer工作液 1 ，配制好后置于冰上放置

2)取2g新鮮幼嫩組織樣品，用冰水清洗干凈

3)用剪刀將樣品組織剪碎，放置于50mL 離心管中

4)加入上述配制好的NIBuffer 工作液1

5)加入 2 mL 36%甲醛溶液，室溫條件下，旋轉(zhuǎn)雜交爐中反應(yīng) 90 min

6)加入2.5 mL 2M甘氨酸，連續(xù)手搖 5 min終止交聯(lián)反應(yīng)

7)濾掉液體，用滅菌水清洗至無(wú)泡沫為止

8)吸干樣品表面水分，將樣品置于預(yù)冷的50ml離心管中，并將管置于液氮中

9)-80℃保存或干冰寄送

二、百邁客 ATAC-seq 取樣要求

1、生物學(xué)重復(fù)

取樣應(yīng)盡量減少重復(fù)間樣品的差異。盡可能做到重復(fù)在取樣時(shí)間、部位、處理?xiàng)l件等方 面保持一致，不同樣本的性別、年齡盡量相同，否則可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性及可信度

每個(gè)處理至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)

2、樣品的保存與運(yùn)輸

簡(jiǎn)單處理并標(biāo)記后，應(yīng)立即浸入液氮中速凍，之后保存于-80℃冰箱，以免實(shí)驗(yàn)操作前 樣品降解的可能性

3、取樣要求

3.1組織樣本

1)獲取組織樣本

A.動(dòng)物：取下新鮮的組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪等雜質(zhì)部分，用預(yù)冷的 1×PBS 溶液漂洗，將組織表面的殘留血液沖洗干凈

B.植物：從植物體上，取下新鮮組織，取材后需用清水將材料表面的灰塵或泥土沖洗干凈，吸干

2)如果組織體積較大，應(yīng)在冰上將組織切成小塊薄片

3)將處理好的組織樣本混合均勻保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中 ，每份組 織>50mg ，準(zhǔn)確標(biāo)記樣品名稱(chēng)

4)迅速置于液氮中冷凍至少 5min ，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存

5)為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣品備份 1-2 份，組織>50mg/份，以防部分樣品降解重新取材、 制備或送樣

6)運(yùn)送方式：將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入 足量的干冰進(jìn)行運(yùn)輸

7)注意事項(xiàng)

A.昆蟲(chóng)類(lèi)樣本建議進(jìn)行饑餓處理后送樣

B.若樣本有微生物污染（細(xì)菌、病毒等），實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會(huì)有污染

3.2細(xì)胞樣本

3.2.1貼壁細(xì)胞

3.2.2懸浮細(xì)胞

1)細(xì)胞獲取

A.將貼壁細(xì)胞用移液器緩慢地吹/刮至懸浮狀，或采用胰酶或 EDTA 消化方法制備細(xì)胞懸液

B.確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好

2)按照 50萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每管進(jìn)行分裝，準(zhǔn)確標(biāo)記后將分裝好的細(xì)胞 4℃、500G 離心 5min。（到公司后解凍， 由我們?cè)偬暨x 5萬(wàn)個(gè)相對(duì)完整的細(xì)胞核進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）

3)小心吸去全部上清，加入 500 μL 預(yù)冷的 1×PBS 溶液洗滌，4℃ 、500G 離心 5min

4)小心吸去全部液體，加入 1 mL 預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，寬口槍頭輕輕吹打細(xì)胞沉淀混勻， 管壁標(biāo)記樣本名稱(chēng)，慢速梯度降溫凍存

5)梯度降溫可參考：4 度 10min＞負(fù) 20 度 30min＞負(fù) 80 度過(guò)夜＞液氮凍存

6)將凍存管置于密封性好的塑料袋中，用膠布纏到冰袋上，并在泡沫盒中裝入足量的干冰 進(jìn)行運(yùn)輸

7)為確保實(shí)驗(yàn)的順利，建議樣品備份 1-2 份，50萬(wàn)個(gè)/份，以防部分樣品降解重新取材，制備或送樣

注：若細(xì)胞樣本有支原體污染，實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)法去除，下機(jī)數(shù)據(jù)會(huì)有污染

3.3全血樣本

1)新鮮血液：每一個(gè)樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝 素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，確保

5天內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室

2)凍存血液：每一個(gè)樣品，建議送樣 1~2 mL 。血液采集后加入含 EDTA 或檸檬酸鈉抗凝管中（因肝素鈉抗凝會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故不建議用肝素鈉抗凝），輕輕顛倒十次混勻，4℃正立放置，平衡

2 h 后直接液氮速凍，干冰運(yùn)輸

3)注意事項(xiàng)

A.取樣前要做好消毒處理：包括取樣部位、取樣器材、取樣者戴的手套等，防止所取血液樣品被物種本身攜帶的細(xì)菌等污染物污染

B.準(zhǔn)備檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多種規(guī)格）

C.依據(jù)抗凝管的實(shí)際規(guī)格采取全血樣品，比如：10mL規(guī)格的抗凝管可以取樣 10mL

D.取完血后，迅速輕柔顛倒混勻全血樣品，保證血液與抗凝劑充分混勻

E.天氣較熱時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)使用冰袋低溫運(yùn)輸，注意，冰袋不要與抗凝 管直接接觸，以防止血液凍凝；天氣較冷時(shí)：含有血液樣品的抗凝管運(yùn)輸時(shí)無(wú)需加冰袋運(yùn)輸

劉恒康博士研究方向?yàn)槔每臻g多組學(xué)探究腫瘤細(xì)胞遺傳變異及其與微環(huán)境的相互作用在腫瘤演化過(guò)程中的規(guī)律和機(jī)制。在本次講座中劉博士分享了一篇發(fā)表于Cancer Cell的封面文章，其中百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。

與以往研究不同的是，這篇文章在研究中同時(shí)納入原發(fā)灶以及侵襲性黑色素瘤，結(jié)合多組學(xué)技術(shù)手段，挖掘腫瘤侵襲的克隆演化規(guī)律的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了AM（原位肢端黑色素瘤）的C3分子亞型預(yù)后更差，這與C3亞型微環(huán)境中浸潤(rùn)更多免疫細(xì)胞以及免疫抑制微環(huán)境相關(guān)。其中APOE+/CD163+巨噬細(xì)胞通過(guò)IGF1-IGF1R促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，這一發(fā)現(xiàn)也在體外細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、額外的患者隊(duì)列中得到了驗(yàn)證，為臨床評(píng)估黑色素瘤患者預(yù)后提供了新的視角，即肢端型黑色素瘤組織中APOE+CD163+雙陽(yáng)與患者更差預(yù)后相關(guān)。

首期 “一作面對(duì)面” 腫瘤專(zhuān)題講座圓滿(mǎn)收官，前沿干貨精彩紛呈！

百邁客生物 “一作面對(duì)面” 腫瘤專(zhuān)題系列講座將持續(xù)推出肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多癌種專(zhuān)場(chǎng)，致力于打造腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域前沿研究的高端分享平臺(tái) —— 聚焦研究思路與成果的深度交流，探索臨床問(wèn)題向科學(xué)研究的轉(zhuǎn)化路徑，解析前沿技術(shù)驅(qū)動(dòng)的認(rèn)知革新，并揭示科研成果的臨床價(jià)值落地邏輯。

誠(chéng)邀腫瘤研究領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者共聚云端

愿思維碰撞出的火花

最終變?yōu)榱一鸱賰舨⊥丛旄V大患者

7月9日19:30

我們下期再會(huì)！

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李霖鋒教授以“雜草稻的起源與適應(yīng)性進(jìn)化”為題，依托《Nature Communications》發(fā)表的題為”Porous borders at the wild-crop interface promote weed adaptation in Southeast Asia”?的文章，以文章中雜草稻基因組組裝及群體進(jìn)化為基礎(chǔ)，延伸介紹了從雜草稻的表性調(diào)研及分類(lèi)，馴化過(guò)程中的品系選育，馴化關(guān)鍵基因選擇以及雜草稻適應(yīng)性進(jìn)化研究對(duì)栽培水稻育種的重要作用等，整場(chǎng)演講深入淺出，引起了各位老師的熱烈討論。

北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院陳為凱副研究員陳老師則以“本氏煙草完整基因組揭示其著絲粒復(fù)雜結(jié)構(gòu)及進(jìn)化歷史”為題，詳細(xì)介紹了老師在《Nature Plants》發(fā)表的題為?“The complete genome assembly of Nicotiana benthamiana reveals the genetic and epigenetic landscape of centromeres”?的研究課題，演講內(nèi)容從煙草的T2T基因組組裝開(kāi)始，深入分析了不同物種著絲粒標(biāo)志序列特征并對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)，整合Chip-seq及甲基化數(shù)據(jù)共同構(gòu)建了本氏煙草著絲粒形成和進(jìn)化的模型，該模型涉及新著絲粒的形成及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等方面信息，整場(chǎng)演講內(nèi)容詳盡思路完整，也引發(fā)了各位在場(chǎng)老師的思考。

百邁客生物高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理聶寧寧圍繞兩位學(xué)者研究中涉及的基因組學(xué)與群體進(jìn)化研究相關(guān)組學(xué)工具展開(kāi)深度解析。

這場(chǎng)學(xué)術(shù)盛宴雖已落幕，但其引發(fā)的思考與探索仍在持續(xù)。7月16日14:00，我們將迎來(lái)第二期直播。屆時(shí)，將有新的行業(yè)權(quán)威專(zhuān)家匯聚一堂，圍繞作物育種領(lǐng)域的新興技術(shù)、前沿理論等展開(kāi)深入探討，為大家?guī)?lái)更多關(guān)于作物育種的創(chuàng)新思路與解決方案。

請(qǐng)持續(xù)關(guān)注百邁客生物官方消息，讓我們共同期待7月16日再次相聚云端，共探作物育種新前沿！

保存方法

試劑盒常溫運(yùn)輸，常溫保存，有效時(shí)間截止開(kāi)封后 60 天。

產(chǎn)品介紹

植物石蠟包埋試劑盒，是一種在保留 RNA 完整性的同時(shí)又可進(jìn)行石蠟包埋獲得結(jié)構(gòu)完整性 更好的植物切片的試劑盒。目前常用的植物切片方法主要有徒手切片法、石蠟切片法、冷凍 切片法。徒手切片需要新鮮組織，即取即用無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間不存組織；冷凍切片法對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu) 大含水量較多的組織無(wú)法保證組織結(jié)構(gòu)的完整性；常規(guī)石蠟切片法無(wú)法保證組織 RNA 完整 性，無(wú)法適用于需要長(zhǎng)期保存且對(duì) RNA 有要求的試驗(yàn)。本試劑盒通過(guò)低溫短時(shí)間固定透明， 并采用特定包埋石蠟可在包埋時(shí)有效降低了組織 RNA 降解。

適用組織類(lèi)型

幼莖、主根（木質(zhì)化程度低）；莖尖分生組織、花芽；生長(zhǎng)期籽粒（淀粉含量低）、胚珠、 花苞、葉片

需要而未提供的材料

Tween20、無(wú)水乙醇、超純水、移液器、離心管、吸頭、0.22um 針頭式過(guò)濾器、真空濃縮儀、 恒溫箱、包埋盒

操作步驟

1 、開(kāi)始前將組織固定液（確定已添加無(wú)水乙醇）吸取 4ml 于 5ml 離心管，放置 4℃預(yù)冷

2 、樣品準(zhǔn)備：用超純水徹底清洗組織表面所有雜質(zhì)，去除目標(biāo)區(qū)域組織周?chē)溆嘟M織并將組織修整為 適合包埋大小。（為了石蠟更好滲透組織一般組織取材長(zhǎng)度不超過(guò) 8mm，厚度不超過(guò) 5mm， 直徑不超過(guò) 1cm；若樣本內(nèi)部有空腔需盡可能暴露空腔，例：包埋花苞樣本時(shí)裁去花苞頂端 閉合的花瓣暴露空腔方便石蠟進(jìn)入)

3 、配置 10ml 0.05%Tween 20 ，并進(jìn)行預(yù)冷

4 、將修整好的組織放入 0.05%Tween20 中，室溫孵育 15min。

5 、取出孵育后的組織，將組織表面的試劑用無(wú)塵紙沾干。

6 、將組織放入預(yù)冷的組織固定液中，顛倒混勻，使組織完全浸沒(méi)并平放于 4℃過(guò)夜固定， 固定時(shí)間為 15-18h ，固定液體積需要超出組織體積的兩倍。同時(shí)將石蠟放置于 38.5℃恒溫 箱進(jìn)行溶解。

7 、吸取 4ml Buffer Ⅰ（確定已添加無(wú)水乙醇）置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出固定后的組織，用無(wú) 塵紙吸取組織表面多余液體，放入預(yù)冷好的過(guò)渡液 1 中，冰上孵育 1h 。同時(shí)將 BufferⅡ至于 38.5℃恒溫箱中溶解。

8 、吸取 4ml 組織透明液置于冰上進(jìn)行預(yù)冷，取出孵育后的組織，用無(wú)塵紙吸取組織表面多 余液體，放入預(yù)冷好的組織透明液中，冰上孵育 1.5h。

*注意：組織在孵育試劑轉(zhuǎn)換的過(guò)程中需快速進(jìn)行，以免組織表面試劑揮發(fā)造成組織表面出現(xiàn)皺縮或風(fēng)干

9 、BufferⅡ顛倒混勻后，取 1.2ml 置于 1.5ml 離心管中，取出孵育后的組織，用無(wú)塵紙吸取組織表面多余液體后將組織放入 BufferⅡ中，將離心管開(kāi)蓋放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空1.5h。

*注意：若組織放入 BufferⅡ后 ，試劑出現(xiàn)凝固可置于恒溫箱中溶解后再進(jìn)行抽真空操作， 真空濃縮儀溫度 42℃ , 壓力小于 40KPa ，轉(zhuǎn)速 1300-1500rpm。

10 、將溶解好的石蠟顛倒混勻，取出離心后的組織，將組織放置于盛有 1.2ml 石蠟的 1.5ml 離心管中，之后將其放入真空濃縮儀中進(jìn)行抽真空 2h ，間隔 1h 跟換一次新石蠟。

11 、抽真空結(jié)束后取出組織，將石蠟加入包埋盒，并將組織按照切片方向放置，調(diào)整好后放 置于冰上凝固冷凍。

*注意：多個(gè)組織需將組織放置于同一平面，且組織需處于包埋盒中間位置，組織任何邊緣不能靠近包埋盒邊緣 ，以免切片組織破碎。

12 、將已凝固的包埋塊小心放于-20℃ , 冷凍 2h。

13 、將已凝固的包埋塊用錫紙包裹小心保存于-80℃ , 避免劇烈磕碰，劇烈磕碰易導(dǎo)致石蠟 塊出現(xiàn)裂縫。

*注意：從-20 轉(zhuǎn)到-80 或者干冰的時(shí)候，包埋盒的底部一定不要接觸到干冰或者冰箱底面?？蓪窈屑芷?，讓其緩慢冷卻 ，快速冷凍石蠟可能會(huì)產(chǎn)生裂紋

常見(jiàn)問(wèn)題分析

1 、固定后組織變色或者部分變色

可能原因：組織固定液造成的組織脫色，不影響后續(xù)包埋可繼續(xù)包埋流程。

2 、石蠟溶解后出現(xiàn)白色團(tuán)塊或未能完全溶解

建議措施： ①升高溶解溫度，待完全溶解后在 38.5℃恒溫。

3 、浸蠟后組織靠中心結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)白色，組織邊緣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)透明 可能原因：組織浸蠟不完全

建議措施：加長(zhǎng)浸蠟時(shí)間，但不可加長(zhǎng)超過(guò) 1h ，浸蠟時(shí)間影響組織 RNA 完整性。

為了推動(dòng)動(dòng)物腸道微生物的深入研究，2025年6月24日，百邁客生物特邀三位深耕該領(lǐng)域的權(quán)威專(zhuān)家，以動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)為核心，開(kāi)展此次主題學(xué)術(shù)沙龍，圍繞動(dòng)物腸道微生態(tài)調(diào)控、菌群功能解析、宿主互作機(jī)制等熱點(diǎn)議題，帶來(lái)高水準(zhǔn)學(xué)術(shù)報(bào)告。這不僅是一場(chǎng)知識(shí)與思想的盛宴，更是探索動(dòng)物健康養(yǎng)殖、疾病防控新路徑的交流平臺(tái)，讓我們共同探討動(dòng)物腸道微生物世界的無(wú)限可能，攜手推動(dòng)學(xué)科發(fā)展與技術(shù)革新！

會(huì)議聚焦：微觀世界大能量

一、反芻動(dòng)物消化道微生物組互作與功能研究

本次沙龍中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所劉孝珍老師探討了反芻動(dòng)物消化道微生物組研究的重要性，并從不同方向展開(kāi)：

• 微生物組研究:通過(guò)宏基因組組裝基因組技術(shù)，解析微生物組結(jié)構(gòu)組成、與宿主和環(huán)境的關(guān)系以及其功能；
• 互作機(jī)制研究:?探究微生物之間的相互作用機(jī)制，例如群體感應(yīng)以及這些機(jī)制如何影響微生物群落結(jié)構(gòu)和功能；
• 暗物質(zhì)開(kāi)發(fā)與利用:?挖掘未被充分認(rèn)知的微生物暗物質(zhì)，包括未被培養(yǎng)的微生物類(lèi)群、非編碼小RNA和未知代謝產(chǎn)物，并開(kāi)發(fā)其潛在應(yīng)用價(jià)值。

二、畜禽微生物研究的變與不變

本次沙龍西北農(nóng)林科技大學(xué)武老師對(duì)國(guó)內(nèi)外關(guān)于畜禽微生物組研究工作進(jìn)行了整體梳理，從以下七個(gè)部分展開(kāi)：

• 胃腸道微生物組目錄構(gòu)建及功能挖掘：利用宏基因組及binning分析進(jìn)行胃腸道宏基因組目錄構(gòu)建及功能挖掘，并介紹了其他胃腸道微生物組研究方法；
• 胃腸道微生物互作研究：介紹微生物間互作關(guān)系，及互作關(guān)系的研究方法；
• 胃腸道微生物-宿主互作：介紹近幾年研究比較多的由胃腸道微生物所產(chǎn)生的代謝物，這些代謝物是如何調(diào)控宿主的一系列功能；
• 宿主-胃腸道微生物互作：該部分內(nèi)容闡明了宿主是如何影響微生物，并介紹了一系列近幾年熱門(mén)的研究方法；
• 消化道穩(wěn)態(tài)營(yíng)養(yǎng)與微生物功能調(diào)控：基于消化道健康的五環(huán)標(biāo)準(zhǔn)，開(kāi)展消化道營(yíng)養(yǎng)研究，例如圍繞生產(chǎn)效率低下、階段性代謝性疾病多和飼料飼草資源短缺等方向開(kāi)展飼料養(yǎng)分高效利用的研究；
• 科赫法則-從微生物到微生物組：介紹了微生物時(shí)代的”科赫法則”，如何去實(shí)現(xiàn)由因果關(guān)系到因果機(jī)制的驗(yàn)證，未來(lái)又該從哪些角度去展開(kāi)；
• 高顏值在線數(shù)據(jù)分析、繪圖與論文組圖

三、“腸-生殖”軸建立的作用機(jī)制探究

本次沙龍內(nèi)蒙古大學(xué)周揚(yáng)老師介紹了她近幾年的研究成果，基于“腸-生殖”軸建立的相關(guān)作用機(jī)制，進(jìn)一步去開(kāi)發(fā)羊營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病的繁殖調(diào)控技術(shù)，研發(fā)提高羊精液品質(zhì)的飼料添加劑。

• 腸-睪軸：構(gòu)建羊代謝紊亂模型，紊亂模型中精子發(fā)生異常、質(zhì)量下降，研究發(fā)現(xiàn)菌群失調(diào)影響膽汁酸水平進(jìn)而影響維生素A吸收，維生素A吸收受阻影響精子發(fā)生，闡明了代謝性紊亂誘發(fā)的反芻動(dòng)物羊繁殖力下降的腸-睪軸新機(jī)制；
• 腸-睪軸：MLT通過(guò)改善腸道菌群的微生態(tài)系統(tǒng)，挽救了代謝素亂疾病引發(fā)的精子發(fā)生異常和睪丸細(xì)胞凋亡，為反芻動(dòng)物羊由代謝素亂引發(fā)的繁殖疾病診斷和防治提供了新的思路；
• 基于腸-生殖軸進(jìn)行后續(xù)研究：通過(guò)補(bǔ)充維生素B1來(lái)預(yù)防母體代謝紊亂對(duì)雌性后代繁殖性能的影響，這項(xiàng)研究為保護(hù)后代繁殖力提供了新的診療思路；
• 羊精準(zhǔn)繁養(yǎng)育一體化：精準(zhǔn)繁養(yǎng)助力良種培育:建立何時(shí)喂，喂多少，喂什么的標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)羊高產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性狀(主要圍繞產(chǎn)肉、產(chǎn)奶)，依托已建立益生元庫(kù)，研發(fā)提升羊肉和羊奶品質(zhì)的新技術(shù)和新產(chǎn)品。

通過(guò)今天的沙龍，我們對(duì)腸道菌群之間的協(xié)同互作，菌群對(duì)代謝的影響機(jī)制等科學(xué)問(wèn)題有了更全面的認(rèn)識(shí)，也對(duì)腸道菌群與宿主的互惠共生關(guān)系有了更深層次的理解。本次沙龍圓滿(mǎn)閉幕，我們將持續(xù)打造第五期微生物領(lǐng)域系列學(xué)術(shù)盛宴，屆時(shí)期待與您在科研長(zhǎng)河中激蕩思想，共濺新浪花！

辣椒（Capsicum annuum）是全球最早且廣泛栽培的蔬菜作物之一，其產(chǎn)生的包括辣椒紅素和辣椒素在內(nèi)的多種次生代謝產(chǎn)物在食品，醫(yī)療和軍工業(yè)都具有重要作用。一直以來(lái)，對(duì)于辣椒的改良主要依賴(lài)于傳統(tǒng)育種方法。相較于同為茄科作物的番茄，辣椒具有龐大而復(fù)雜的基因組，且其中超過(guò)80%為轉(zhuǎn)座子或重復(fù)序列。研究表明，轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列是轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的重要來(lái)源，由此暗示了辣椒基因組中含有豐富的順勢(shì)調(diào)控元件以及多樣的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式，而調(diào)控元件的變化是動(dòng)植物進(jìn)化和馴化的主要驅(qū)動(dòng)力之一。

該研究以樟樹(shù)港辣椒為模型，系統(tǒng)揭示了辣椒在全基因組范圍內(nèi)的表觀特征，并在此基礎(chǔ)上推測(cè)包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在內(nèi)的瞬時(shí)調(diào)控元件。研究發(fā)現(xiàn)，辣椒啟動(dòng)子主要由H3K4me3,?H3K27ac和開(kāi)放染色質(zhì)共同修飾，而增強(qiáng)子的特征為開(kāi)放染色質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，該研究對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育以及脅迫響應(yīng)的調(diào)控元件進(jìn)行了挖掘，并對(duì)部分元件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，該研究報(bào)道了辣椒基因組基因間區(qū)H3K4me1和H3K27me3共同修飾的區(qū)域，推測(cè)為暫時(shí)未表達(dá)（poised）的調(diào)控元件，其具體分子功能有待驗(yàn)證。

綜上，該研究系統(tǒng)挖掘辣椒基因組中重要的順勢(shì)調(diào)控元件，以及其調(diào)控的靶標(biāo)基因，不僅為基因調(diào)控研究提供了基礎(chǔ)，也為通過(guò)靶向遺傳和表觀遺傳操作改良辣椒品種提供了理論支持。

以上內(nèi)容來(lái)源于北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，侵刪

1.1植物組織：CTAB法

1)液氮研磨樣品，分裝至離心管中

2)向離心管中加入 CTAB，水浴

3)離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心

4)向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清

5)加入 75％乙醇，離心，棄上清

6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2動(dòng)物組織：SDS法

1)液氮研磨組織樣，分裝至離心管中

2)加入 SDS 溶液，水浴

3)加入 NaCl 溶液，靜置后離心

4)向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心

5)向上清中加入異丙醇后離心，棄上清

6)加入 75％乙醇，離心，棄上清

7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101

1.4粗體核酸純化

試劑盒名稱(chēng)：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223

試劑盒名稱(chēng)：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243

1.5微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

1)濃度檢測(cè)

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000

Qubit：invitrogen ，型號(hào)QubitTM3Flurometer

2)完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600

電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥2μg（單次建庫(kù)）

2)濃度≥50ng/ul

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280在1.7-2.2之間，OD260/230在1.7-2.5之間

5)AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無(wú)或有輕微污染，N/Q在0.9-2.0之間

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)

3、建庫(kù)方法

3.1建庫(kù)流程

1) 準(zhǔn)備高質(zhì)量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化

2)使用BluePippin進(jìn)行片段篩選

3)使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加 A

4)使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒添加 barcode 序列

5)使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒完成測(cè)序接頭的連接

3.2建庫(kù)試劑

1)文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號(hào) M6630L 廠家 NEB

2)文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號(hào)E7546L 廠家NEB

3)文庫(kù)構(gòu)建試劑：無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒1-96 貨號(hào)SQK-NBD114.96 廠家Nanopore

3.3建庫(kù)設(shè)備

數(shù)字 3*32PCR 儀 廠家 Appliedbiosystems 儀器規(guī)格 proflex3*32

制冷型程控五段金屬浴 廠家 天根生化科技（北京）有限公司 儀器規(guī)格 OSE-DB-02

4、測(cè)序方法

4.1上機(jī)操作

1)用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix

2)用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫(kù)

3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開(kāi)始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)

4.2測(cè)序試劑

測(cè)序芯片制備試劑盒 貨號(hào) EXP-FLP004 廠家 Nanopore

測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒 貨號(hào) EXP-AUX003 廠家 Naonopore

測(cè)序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 貨號(hào) FLO-PRO114M 廠家 Nanopore

4.3測(cè)序設(shè)備

PromethION48 測(cè)序儀 廠家 Nanopore 儀器規(guī)格 PromethION48