百邁客合作NC|雷山髭蟾基因組揭示兩棲動物性二態(tài)分子機制

2019年12月5日，國際知名期刊Nature Communications （《自然·通訊》）在線發(fā)表了由華中師范大學(xué)與北京百邁客生物科技有限公司共同合作文章“Genomic and transcriptomic insights into molecular basis of sexually dimorphic nuptial spines in Leptobrachium leishanense”。華中師范大學(xué)生科院吳華教授為本文通訊作者，華中師范大學(xué)生科院李軍博士為論文的第一作者，百邁客生物科技作為第二單位共同參與研究。本研究借助二代、三代PacBio和HiC技術(shù)組裝了我國特有物種雷山髭蟾（Leptobrachium Leishanense）高質(zhì)量基因組，通過比較基因組學(xué)分析及雌雄個體不同發(fā)育時期的有參轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了一系列與角質(zhì)刺性二態(tài)發(fā)育相關(guān)的生物學(xué)通路和關(guān)鍵基因。研究成果首次較全面地解析了兩棲動物性二態(tài)形成相關(guān)的重要生物學(xué)通路以及關(guān)鍵基因，彌補了相關(guān)研究的不足。該成果不僅為兩棲動物基因組數(shù)據(jù)庫提供了高質(zhì)量的參考基因組，而且對于深入理解脊椎動物性二態(tài)形成及調(diào)控的分子機制具有重要意義。

研究背景

在雌雄異體的有性生物中，兩性之間在體型大小、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能等方面存在明顯差異的現(xiàn)象稱為性二態(tài)（Sexual dimorphism）。自然界普遍存在的性二態(tài)（如劍尾魚的劍狀尾和獅子的鬃毛等）一直是進化生物學(xué)家關(guān)注的熱點問題。兩棲動物具有豐富的性二態(tài)特征，繁殖期的雄性雷山髭蟾在上頜的皮膚形成角質(zhì)刺，類似于人類的“胡子”，因此又被稱為“胡子蟾”，繁殖期過后，角質(zhì)刺外殼會脫落，而雌性則沒有這種特征。由于除了性染色體上的基因外，大多數(shù)的基因組在雄性和雌性之間是共享的，所以性二態(tài)往往是由基因在性別間差異性表達引起的。由于缺乏參考基因組，很少有研究能夠?qū)⑿詣e差異表達模式與特定的性二態(tài)特征聯(lián)系起來，與性二態(tài)性狀相關(guān)的重要生物學(xué)過程和關(guān)鍵基因也一直難以破解。本文成功的建立了一個具有代表性的鋤足蟾亞目基因組，并對其皮膚來源的性二態(tài)性狀進行了分子基礎(chǔ)的研究。

研究材料

基因組（Illumina、PacBio測序）：成熟雄性雷山髭蟾肌肉組織
HiC：成熟雄性雷山髭蟾全血
轉(zhuǎn)錄組基因預(yù)測：腦、精巢、肝、心、腎、脾、肌肉、上頜皮膚（MS）、背部皮膚（DS）
轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：亞成年期、繁殖期、繁殖后期雌性及雄性的上頜皮膚、背部皮膚、腦、性腺組織（圖1）
qPCR驗證：雌性及雄性繁殖期上頜皮膚、背部皮膚。

圖1 雷山髭蟾雌雄外形特征及取樣示例

分析內(nèi)容

1、雷山髭蟾基因組的組裝注釋及結(jié)構(gòu)特征分析

2、與其他六種無尾兩棲類的比較基因組分析

3、兩種性別和三個發(fā)育階段多組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析及qPCR驗證

4、兩種性別和三個發(fā)育階段的基因共表達分析

主要結(jié)果

1. 雷山髭蟾基因組的組裝注釋及結(jié)構(gòu)特征分析
k-mer分布估計基因組大小為3.56 Gb（k=21，圖2）。通過PacBio（~80×）+Illumina（~50X）+Hi-C（~44X）技術(shù)組裝出3.54 Gb基因組，并將3.31 Gb（92.9%）基因序列定位到13條染色體上，contig N50為1.93 Mb，scaffold N50為395 Mb（表1，圖3）。CEGMA評估顯示組裝基因組中包含的保守基因占97.2%，BUSCO評估顯示組裝基因組中完整基因數(shù)占97.2%，表明組裝的基因組具有較高的完整性。雷山髭蟾具有77.1%（2.73Gb）的重復(fù)序列，高于大多數(shù)已完成測序的無尾目物種（表1）。本次研究獲得了鋤足蟾亞目代表性物種染色體水平基因組的組裝。

圖2 k-mer分布圖

圖3 Hi-C交互信號

表1 雷山髭蟾與其它無尾目物種基因組比較

通過基因組共線性研究雷山髭蟾L. leishanense和熱帶爪蟾?X. tropicalis的基因組結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，兩個物種之間存在著大量的染色體共線性（圖4 b）。L. leishanense染色體數(shù)目是13，而?X. tropicalis的染色體數(shù)目是10，這種差異是源于L. leishanense的染色體分裂。X. tropicalis染色體（Xtr）4、7和8上的同源共線性區(qū)段分布在L. leishanense基因組中的兩個獨立染色體上（分別為Lle8+10、6+11和9+13）。在L. leishanense的基因組中，346個共線性區(qū)段中有179個倒位。經(jīng)PacBio reads驗證，X. tropicalis的Xtr2、3、6、9、10等7個區(qū)域（502 Kb-5.9 Mb）易位到與相應(yīng)同源染色體不同的L. leishanense染色體上（圖5）。

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圖4? 雷山髭蟾與其它無尾目物種基因組比較

圖5 HiC互作信號鑒定雷山髭蟾染色體倒位

2.?與其他六種無尾目動物的比較基因組分析
通過單拷貝直系同源基因進行進化樹的構(gòu)建，七個無尾目物種最近的共同祖先（MRCA）估計發(fā)生在2.101億年前（176.2-248.8 Ma），L. leishanense與新蛙亞目的物種在約185.9 Ma發(fā)生分化（圖6）。與MRCA相比，L. leishanense共有107個基因家族顯著擴張（圖6），擴張家族的基因主要富集于信號反應(yīng)類型，包括嗅覺、刺激反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。與細胞增殖、凋亡和存活等多種細胞功能的調(diào)節(jié)和對細胞外刺激的反應(yīng)中起重要作用的PI3K-Akt信號通路在L. leishanense中顯著擴張。與免疫反應(yīng)相關(guān)生物過程相關(guān)基因發(fā)生顯著且特異性的擴張。還需要進一步的分析和實驗數(shù)據(jù)來探討其生境適應(yīng)與免疫應(yīng)答相關(guān)基因擴張的關(guān)系。

圖6?無尾目動物比較基因組分析

在擴張的基因家族中，兩個編碼中間絲（Intermediate Filament, IF）蛋白的基因家族在L. leishanense基因組中顯著擴張（圖6）。這兩種擴張的基因家族包括編碼角蛋白的基因，角蛋白是上皮細胞的成絲蛋白，參與脊椎動物角質(zhì)化組織的形成，如人的頭發(fā)和指甲。在哺乳動物中，表皮堅硬組織的一個重要組成部分是兩類α-角蛋白（稱為Ⅰ型和Ⅱ型α-角蛋白），基因組分析表明人類共有54個功能性角蛋白基因（28個Ⅰ型和26個Ⅱ型），分別聚集在兩條染色體上。在L. leishanense中，共鑒定出101個完整的α-角蛋白基因，包括53個I型和48個II型基因，這遠遠高于在其他物種中觀察到的此類基因的數(shù)量。通過比較α-角蛋白基因的基因組分布，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型α-角蛋白基因分別聚集在L. leishanense的兩條染色體（Lle 12和Lle 2）上，而且側(cè)翼基因與其它脊椎動物的基因相同，暗示角蛋白基因序列的保守性。在哺乳動物（人和小鼠）和L. leishanense及其他無尾目動物中，存在多個物種特異性的角蛋白基因簇，這是角蛋白基因庫擴大的主要原因（圖7a）。L. leishanense中發(fā)生串聯(lián)復(fù)制的角蛋白基因與哺乳動物的毛發(fā)角蛋白（Hair Keratins, HKs）同源（圖7a）。L. leishanense中HK同源基因的拷貝數(shù)幾乎是其他無尾類的兩倍（圖7a）。

為了進一步探討高重復(fù)HK基因與L. leishanense?SD角質(zhì)刺的相關(guān)性，研究者對表達的RNAs（RNA-seq）進行了測序，并比較了HK和非HK基因在多個樣本中的表達模式。研究發(fā)現(xiàn)，L. leishanense中的I型和II型重復(fù)HK基因在繁殖期（B）雄性MS中表現(xiàn)出雄性偏向性和MS特異性的高表達，而非HK基因在兩性MS和DS中的表達相似（圖7?b）。這些結(jié)果表明IF基因家族的擴張，特別是高度重復(fù)的HK基因，與L. leishanense角質(zhì)刺的發(fā)生緊密相關(guān)。

圖7 角蛋白基因家族的基因組分布和表達模式

3. 兩種性別和三個發(fā)育階段多組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析及qPCR驗證
為了研究L.leishanense中與角質(zhì)刺性二態(tài)相關(guān)的生物學(xué)過程，研究人員對MS的轉(zhuǎn)錄組進行了兩種性別和三個發(fā)育階段的測序（表2）。同時對兩種性別和三個階段的DS轉(zhuǎn)錄本作為對照。對于每個發(fā)育階段，進行了三組獨立比較（圖1）：（1）雄性和雌性MS的比較；（2）雄性MS與DS的比較；（3）雌性MS與DS的比較。確定差異表達基因（DEGs），并進行了GO和KEGG的富集，以檢查基本的生物學(xué)過程和途徑。

表2?轉(zhuǎn)錄組分析組織代號

亞成年期(A)，雄性MS和DS之間的差異表達基因（DEGs）主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程和骨骼發(fā)育相關(guān)過程，而在雌性中類似的生物學(xué)過程沒有發(fā)生富集繁殖期(B)，兩性MS中差異表達基因大多富集在激素活性和上皮細胞分化過程，雄性MS和DS之間的DEGs也有類似的生物過程富集，但在相同的雌性比較中卻沒有；繁殖后期(C)，雄性MS和DS的DEGs在含有多個編碼胰蛋白酶和組織蛋白酶基因的蛋白水解過程中顯著富集，可能是通過蛋白水解過程來引起角質(zhì)刺脫落。

圖8?雷山髭蟾中與角質(zhì)刺產(chǎn)生相關(guān)顯著富集的生物過程

為了探討L.?leishanense中角質(zhì)刺的激素調(diào)節(jié)，研究者對來自大腦和性腺的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了測序（表2）。研究發(fā)現(xiàn)B期雄性和雌性之間的DEGs（BM3-BF3）和A期和B期雄性之間的DEGs（AM3-BM3）中的神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑顯著富集，在這些基因中，LH（黃體生成素）和FSH（卵泡刺激素）編碼肽激素，通過血液進入性腺刺激類固醇激素的合成（圖9）。相關(guān)基因的表達表明雄性在繁殖季節(jié)中下丘腦-垂體-性腺軸的激活。雄性精巢在不同時期的類固醇激素生物合成途徑顯著豐富。在這條途徑中，編碼參與性類固醇生物合成的酶的基因在B期雄性精巢中高度表達（圖9），表明B期雄性精巢中雄激素（睪酮和5α-DHT）生物合成水平較高。

除了性腺外，皮膚是主要的非經(jīng)典組織，通過功能性活性酶的表達促進類固醇生成。在L. leishanense中，雄性和雌性MS之間的DEG也在類固醇生物合成過程中顯著富集。這些酶的高表達表明雄性MS中雄激素C19類固醇的積累。然而，單靠雄激素不足以支持雄性的性二態(tài)特征，其他激素也起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素（TH），催乳素（PRL）和松弛素（RLN）可能參與調(diào)節(jié)過程?！凹谞钕偌に剞D(zhuǎn)運（thyroid hormone transport）”在BM2–BF2和BM1-BM2的DEGs中高度富集（圖8）。

圖9?腦和性腺成對比較中顯著富集的激素相關(guān)途通路

4.?兩種性別和三個發(fā)育階段的基因共表達分析

為了進一步確定控制角質(zhì)刺生長的關(guān)鍵基因，研究者分析了基因共表達網(wǎng)絡(luò)，并使用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）鑒定了基因模塊（genetic module），試圖找出與特定性狀相關(guān)的模塊（可能表現(xiàn)出相同生物活性的高度相關(guān)基因）。共表達網(wǎng)絡(luò)揭示了Wnt通路、角蛋白基因krt、黑色素合成相關(guān)的酪氨酸酶基因tyr以及轉(zhuǎn)錄因子hoxc13等參與形成角質(zhì)刺結(jié)構(gòu)（圖10）。

圖10 WGCNA分析基因共表達模塊和網(wǎng)絡(luò)

小結(jié)

本文以雷山髭蟾為研究對象，建立了一個具有代表性的鋤足蟾亞目基因組。這項研究不僅提供了一個高質(zhì)量的兩棲動物基因組，并揭示了雷山髭蟾角質(zhì)刺產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)。對于深入理解脊椎動物性二態(tài)形成及調(diào)控的分子機制具有重要意義，類似的分子調(diào)控模式也為今后兩棲動物皮膚起源的性二態(tài)研究提供指導(dǎo)。

 

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