微生物多樣性測(cè)序分析

數(shù)據(jù)下機(jī)后根據(jù)PE reads之間的Overlap關(guān)系，將Hiseq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接(Merge)成一條序列Tags，同時(shí)對(duì)Reads的質(zhì)量和Merge的效果進(jìn)行質(zhì)控，主要包括去除低質(zhì)量Tags和去嵌合體

根據(jù)97%的相似度進(jìn)行OTU聚類后，基于Silva（細(xì)菌）和UNITE（真菌）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋，得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而在各水平（phylum，class，order，family，genus，species）統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成，繪制樣品在各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)柱狀圖，柱狀圖展示不同樣品中物種的組成和相對(duì)豐度。

Alpha多樣性（Alpha diversity）反映的是單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，有多種衡量指標(biāo)：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指數(shù)簡(jiǎn)單的反映出群落中物種的數(shù)量；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量群落多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度（Community evenness）的影響。Chao1、Ace、Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。另外還統(tǒng)計(jì)了樣本文庫(kù)的覆蓋率 Coverage，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒有被測(cè)出的概率越低。

Beta多樣性分析主要采用 binary jaccard、 bray curtis、 weighted unifrac(限細(xì)菌)、 unweighted unifrac (限細(xì)菌)等4種算法計(jì)算樣品間的距離從而獲得樣本間的β值。這四個(gè)算法主要分為兩大類：加權(quán)（Bray-Curtis和Weighted Unifrac）與非加權(quán)（Jaccard和Unweightde Unifrac）。利用非加權(quán)的計(jì)算方法，主要比較的是物種的有無(wú)；而加權(quán)方法，則需要同時(shí)考慮物種有無(wú)和物種豐度兩個(gè)問題。樣品間距離越小，說(shuō)明兩個(gè)群體的物種組成越相似。

LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析主要用于發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker，根據(jù)設(shè)定的Biomarker篩選標(biāo)準(zhǔn)（LDA score>4）找出符合條件的Biomarker。

PCA是一種分析和簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，通過(guò)將方差進(jìn)行分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，通過(guò)分析不同樣品 OTU（97%相似性）組成可以反映樣品的差異和距離，PCA運(yùn)用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映方差的兩個(gè)特征值。圖中兩個(gè)樣品距離越近，則表示這兩個(gè)樣品的組成越相似。

16S功能預(yù)測(cè)基于PICRUSt軟件通過(guò)比對(duì)16S測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測(cè)樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。

網(wǎng)絡(luò)圖是相關(guān)性結(jié)果的一種表現(xiàn)形式，根據(jù)各個(gè)物種在各個(gè)樣品中的豐度以及變化情況，使用sparcc算法進(jìn)行相關(guān)分析，圖中線的粗細(xì)代表相關(guān)性的強(qiáng)弱；線的顏色表示相關(guān)性：紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)。