動物測序樣品怎么做？動物樣品制備和運輸指南

 

1、前言

1.1適用范圍

本指南介紹百邁客動物類組織&核酸樣品的送樣要求及制備方法。采集送樣前請詳細閱讀。信息單中樣本名稱、組織部位必須與實物相符，避免因信息單與實物不符導致反復核對，影響樣本質量、錄入周期，導致提取核酸質量不滿足建庫測序要求，實驗周期過長等

1.2聲明

對于危害程度為第一、二類的高致病性樣品，只接收提取后的核酸樣品，不接收組織樣。對于危害程度為三、四類的致病性或傳染性的組織樣，必須先通過銷售或運營與醫(yī)學實驗平臺負責人溝通，確認無高致病和傳染性且能進行后續(xù)實驗后再安排樣品寄送。危害程度的判定標準具體參見《人間傳染的病原微生物名錄》

1.3提取風險提示

核酸提取質量與物種及組織部位、樣本制備、樣本交接、提取方法與操作、以及環(huán)境等因素息息相關，尤其是三代超長提取對樣的要求更高。組織提取時可能受到上下游處理操作的影響，因此較難保證單次提取滿足質量要求，望老師知悉理解，并做好組織備份。為保障獲得相對較高質量的核酸，請老師務必按照以下指導原則準備樣本。對于珍貴樣本或微量樣本，建議自行提取

2、組織送樣量要求

注意：未在表格出現(xiàn)的物種，請單獨溝通。送樣量結果展示為滿足提取一次的量，如樣品經過特殊處理或樣本狀態(tài)異常有幾率影響得率，為了保證您的實驗可以順利進行，請酌情增加送樣量

2.1常規(guī)動物類組織送樣要求

2.2動物類血液送樣量

2.3動物類細胞送樣量

3、核酸送樣要求

1)核酸送樣需要提供相關檢測結果，DNA類核酸可提供以下檢測手段中的一種或多種檢測結果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同時請采取適當?shù)募兓椒ǎ员苊舛嗵?、多酚、蛋白或者核酸酶對DNA樣品的污染，并詳細注明溶解DNA所使用的溶解液類型

2)如果您開展的實驗項目為miRNA的相關實驗，并且提供的是總RNA的樣本，請務必確認您采用的總RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取試劑盒型號備注送樣信息單中

3.1二代DNA送樣量要求

3.2三代DNA送樣量要求

3.3RNA類送樣量要求

1)針對核酸有雜質、污染、粘稠、顏色等情況，需要過柱純化后送樣或者酌情增加送樣量

2)核酸樣品建議使用1.5ml、2ml EP管裝載樣品，其他保存管容易破裂且不利于保存樣品和后續(xù)實驗的開展

3)為了防止樣品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板裝載樣品

4)用乙醇沉淀的樣品由于運輸中會有少量乙醇揮發(fā)，建議將樣品管蓋用封口膜纏繞4-5圈

5)考慮到核酸可能存在含有雜質、顏色等物質導致會產生大量損失的風險，為保證樣本一次檢測合格并節(jié)約寶貴的重送樣時間，送樣建議量是高于公司判定標準的，請在核酸量足夠的前提下盡量按

4、樣品制備保存指南

4.1常規(guī)動物類樣本（脊柱動物、哺乳動物）

常規(guī)動物主要包括脊椎動物組織樣本主要包括：哺乳動物、禽類、爬行動物以及兩棲動物。送樣需要選擇新鮮采集的樣本，尤其是Ultra long ONT建庫，樣本的取材優(yōu)先選擇核酸含量相對較高的組織，樣本制備優(yōu)先級：血液>內臟>肌肉?；铙w取下新鮮組織（肌肉、肝臟或其他組織，避免用易于寄生微生物的表皮和腸道、可能有變異細胞的病變組織），立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應盡可能準確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應將周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內容物清洗干凈

4.1.1液氮速凍組織操作流程（所有產品適用）

1)提前準備好冷凍組織的足量液氮，預裝樣品的凍存管，并在做好標記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內）

2)活體取下新鮮的組織

3)迅速用預冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4)如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5)將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標注編號

6)立即（20s內）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉移至-80 °C長期保存

7)干冰運輸

4.1.2TRIzol保存樣品制備流程（僅RNA細胞組織適用）

1)如果使用 TRIzol裂解液保存送樣，請務必先進行液氮研磨破碎，樣品量取參考標準送樣量的1/3，然后溶于 TRIzol 中，組織樣品切勿過量

2)震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機12000g離心10min，將上清液轉至新的2.0ml離心管中（拍質控照片，方便核查），轉移至-80℃低溫保存，運輸時選擇干冰寄送

3)禁止使用trizol保存組織樣品送樣

4.1.3RNAlater? Tissue Collection保存樣品制備流程（僅RNA適用）

1)用RNAlater? Solution保存組織之前，需要將組織切割成長寬高均≤ 0.5 mm的小塊

2)如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater? Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉移至-20 °C 或-80 °C 長期保存

3)RNAlater? Solution 不會影響組織結構，可以把已保存的組織從 RNAlater? Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存

4)保存于RNAlater? Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結凍， 在進行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存

5)一般來講，生物樣本保存于RNAlater? Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復性，建議所有保存于RNAlater? Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存

4.2全血

DNA類產品推薦使用EDTA抗凝管采集后分裝，RNA類產品優(yōu)先推薦使用PAXgene血液RNA管采集。血樣建議為新鮮采集，不建議保存時間過長。血液相關產品僅接收全血或分離的細胞樣本，不接收血清、血漿

4.2.1DNA常規(guī)產品制備操作流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3)干冰運輸

注1：血液采集管請盡量不要用需專門對應提取試劑盒的采血管，以防送樣后我們因無對應試劑盒影響提取時間（盡量送樣前溝通）

注2：采集完血液之后需將血液轉移至EP管中，玻璃材質采血管冷凍之后易碎

4.2.2Ultra Long ONT樣本制備流程

4.2.2.1新鮮血液

1)采集血液（ 5- 10mL），然后加入含 EDTA 抗凝管中（不可使用肝素 、檸檬酸鈉等抗凝管，建議使用 Cell-Free 采血管，做好標記（樣本名稱，日期，體積）

2)輕輕顛倒混勻十次，室溫正立放置

3)冰袋（4 °C ）運輸需避開節(jié)假日（注意冰袋盡可能多放，樣本置于中間，保證箱體溫度維持在 4 °C）。從血液離體算起，運輸至實驗人員手中不可超過 3 天

4.2.2.2凍存血液

1)血液用抗凝管采集后輕輕顛倒混勻十次

2)哺乳動物血液分裝到 2ml 離心管里，1ml/管（至少2管，若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）

3)魚類、禽類、兩棲類全血分裝到 1.5ml 離心管里， 100ul/管（至少5管,若血量不足，可根據(jù)實際情況送樣）

4)做好標記（樣本名稱， 日期，體積），液氮速凍，干冰寄送

4.2.3RNA產品制備操作流程

4.2.3.1PAXgene血液RNA管制備流程（人和靈長類動物優(yōu)先選擇該方式送樣）

1)PAXgene管的介紹

在研究細胞內 RNA 使用的許多分子測試中，采集全血是第一步。 這類測試中的最大挑戰(zhàn)是細胞內 RNA不穩(wěn)定，在采血后幾小時內迅速降解。 此外，通過基因誘導過程，某些種類的 RNA 采血后在體外增加。 體外 RNA 降解和基因誘導均會導致體內基因轉錄物相對數(shù)量估計過低或過高。 PAXgene 血液RNA 管含有一種附加劑，通過減少體外 RNA 降解和盡量減少基因誘導，可穩(wěn)定體內基因轉錄譜。 與PAXgene 血液 RNA 套件配套使用時，PAXgene 血液 RNA 管可以實現(xiàn)準確的基因轉錄物檢測和定量

2)采集前準備

A.PAXgene Blood RNA Tube（2.5mL采血管，含專用RNA穩(wěn)定劑）

B.符合標準的靜脈采血裝置（無菌針頭、持針器、止血帶等）

C.毒用品（酒精棉片、碘伏等）

D.生物安全防護裝備（手套、護目鏡等）

3)采集流程

A.確保 PAXgene 血液 RNA 管使用前在 18-25?C 溫度下，且正確貼有標本識別標簽

B.如果 PAXgene 血液 RNA 管是待抽吸的唯一試管，應當先抽血至“丟棄管”，再抽血至 PAXgene 血液 RNA 管，這樣便可以灌注放血過程中使用的采血裝置的內部空間。 否則，PAXgene 血液 RNA 管應是放血程序中最后抽吸的試管

C.采用您所在機構推薦的標準靜脈穿刺技術程序，使用采血裝置和試管固定器，采血2.5ml至 PAXgene 血液RNA 管

D.采血后立即輕輕地將PAXgene 血液 RNA 管倒置 8–10 次

E.在室溫下 (18–25?C) 直立存儲 PAXgene 血液 RNA 管至少 2 小時，最多 72 小時，然后再處理或轉移至冷藏室 (2–8?C) 或冷凍室 (-20?C)。 若需要 -70?C / -80?C 的存儲溫度，請參見“PAXgene 血液RNA 管內所采集標本的冷凍和解凍程序” 以獲取詳細信息

4)注意事項

A.確保采血管在有效期內，無漏液或變色（正常試劑為淡黃色）

B.不可預先打開管蓋，避免穩(wěn)定劑失效

C.一旦受到碰撞，冷凍的 PAXgene 血液 RNA 管就容易破裂。為降低在運輸期間破裂的風險，請按照處理玻璃管的方式來處理冷凍的試管。使用者必須確認自己的 PAXgene 血液 RNA 管冷凍和運輸協(xié)議

D.PAXgene 血液 RNA 管填充不足會導致血液與附加劑的比率錯誤，且可能導致分析結果錯誤或產品性能欠佳

E.PAXgene血液 RNA 系統(tǒng)不適用于采集和純化病毒 RNA

4.2.3.2EDTA抗凝管送樣制備流程

1)用醫(yī)用抗凝管或已裝有抗凝劑（選用檸檬酸鈉或 EDTA 抗凝劑，由于會影響實驗所以不可用肝素）的旋蓋管收集全血樣本

2)上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中（體積不要超過EP管的一半），轉移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3)干冰運輸

4.3昆蟲

1)昆蟲樣本，需進行表面微生物的清洗，某些吸血性昆蟲，例如蚊子，血吸蟲，該類型樣本可能存在外源污染，需要進行切腹，去除腸道處理。較大個體的選取不帶腸道部分的組織，將組織切成長寬高均≤0.5 cm 的小塊（即黃豆大小），對于較小個體只能用整個個體的，應進行適當?shù)酿囸I處理（注意保證昆蟲的活性）

2)提前準備好冷凍組織的足量液氮，預裝樣品的凍存管，并做好標記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內）

3)轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

注1：小型昆蟲組織務必在信息單中備注微量樣本需液氮交接防止降解。同時該類樣本因只滿足一次或低于常規(guī)一次提取用量，我們無法保證100%提取合格

注2：蜜蜂送樣時盡量要求老師取胸部肌肉送樣，整個蜜蜂送樣提取的核酸狀態(tài)大多數(shù)異常，影響后續(xù)實驗。不建議送實驗室剔除，因為組織速凍過之后再剔除會化凍，提取降解的可能性較大

4.4微生物

4.4.1細菌

1)顯微鏡下觀察細菌生長狀態(tài)，建議收集生長期處于對數(shù)期的細菌

2)將適量體積的菌液轉移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min

3)棄掉培養(yǎng)基，將細菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉移至-80 °C長期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸

5)以下為不規(guī)范送樣圖片：菌體平板（左圖），菌液送樣（右圖）

4.4.2真菌

4.4.2.1單細胞真菌

單細胞真菌以酵母菌為代表。一次提取反應所需酵母菌的量需≤1×107個，以 5×106-1× 107個為宜。您要做的項目要求送樣量較大時，可以將樣品按上述數(shù)量要求分裝后單獨保存

1)顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，最好收集生長期處于對數(shù)期的酵母菌

2)將適量體積的酵母菌液轉移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min

3)棄盡培養(yǎng)基，將酵母細胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉移至-80 °C長期保存

4)將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運輸

4.4.2.2多細胞真菌（大型真菌）

1)取完整菌體，先用大量清水沖洗其表面雜質，再用純水清洗一遍，使用吸水紙吸干表面的水份后，用剪刀將組織分割為小塊，做好標記（樣本名稱，日期,，體 積）放液氮里速凍，干冰寄送

2)菌絲：將無菌棉簽輕輕觸碰菌落或菌斑的中心部分，避免碰到邊緣或其他細菌來源。然后，將棉簽迅速劃過培養(yǎng)基表面，以收集菌絲轉移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。(可根據(jù)樣品量收集多管或使用15mL螺旋管收集）

4.5水產類

水產類包括淡水魚類、海水魚類、貝類、藻類。送樣需要選擇新鮮采集的樣本

1)優(yōu)先選用新鮮采集的樣品送樣，稀有樣本可酌情選取凍存組織。采集樣品時應選取核酸含量較多的部位

2)取得活體組織后，用清水清洗，以去除污物，吸干表面液體

3)活體取材后用預冷的0.9%生理鹽水進行清洗，去除血漬和污物

4)將樣品分割成50 mg左右的小塊（約黃豆大?。瑯悠贩指詈吞幚頃r應盡量在冰上進行，防止樣品降解。避免裝樣太滿以至凍裂，造成樣品污染

注：水產類樣品需盡量保證為新鮮個體。盡量避免寄送保存時間較長或經過反復凍融的組織樣品。針對軟體動物可先使用75%的乙醇進行漂洗，漂洗干凈后液氮冷凍，干冰運輸；針對刺胞動物，可去除頭部和腸道等部位，保留肌肉外壁用于提取

4.6細胞

4.6.1貼壁細胞

4.6.1.1液氮速凍法

1)確定細胞生長狀態(tài)良好；離心得到細胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.6.1.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol

2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.6.2懸浮細胞

4.6.2.1液氮速凍法

1)確定細胞生長狀態(tài)良好；離心得到細胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）

2)棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細胞沉淀懸起， 轉移至 2 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中

3)離心（依據(jù)客戶實驗室細胞離心步驟，注意細胞離心要適度，不要使細胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機，轉速800g為宜）得到細胞沉淀，棄去PBS，液氮速凍2h之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

4.6.2.2TRIzol裂解法

1)離心收集的細胞迅速溶于 TRIzol 裂解，每 5 X 10^6個細胞加 1 mL TRIzol

2)細胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團，需用吸頭將細胞團吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解

3)室溫靜置5min，之后轉移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送

5、注意事項

核酸提取質量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實驗器材及環(huán)境等因素均有密不可分的聯(lián)系，尤其是三代超長提取對樣本的質量、總量要求更高，望知悉及理解，并做好樣本備份。為了保障獲得高質量的核酸，請務必按照送樣手冊所規(guī)定的準備樣本。對珍貴樣本或者微量樣本，建議自行提取。

1)組織速凍時間：組織離體后，胞內核酸便開始降解，尤其是 RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議 3min 內完成，越快越好。速凍時間過短會導致速凍不徹底，核酸有降解風險

2)組織送樣量：建議送樣量適用于 95%的物種組織，少部分組織因胞內核酸量較低，需適當增加送樣量，比如動物皮膚、毛發(fā)等。請嚴格按照上方組織送樣量要求送樣，送樣量過少或過多均不利于提取實驗。采樣量較少會導致提取的核酸總量、濃度不合格，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險

3)組織狀態(tài)：不建議送組織狀態(tài)差或非生長旺盛期樣品，核酸有一定幾率降解

4)組織保存管的選擇：所有組織樣品務必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋（低溫凍脆易破裂，導致樣品泄露，交叉污染）保存

5)組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。未使用液氮速凍或液氮速凍時間過短都有一定幾率導致核酸降解

6)組織送樣方式的選擇：干冰運輸，且需要保證干冰的充足，冰袋和常溫送樣，有幾率導致核酸的降解。除RNA類樣品可使用RNAlater保存送樣，其余產品均建議送速凍組織，不建議使用保護液送樣，化開離心會有幾率導致核酸降解；不建議酒精送樣，固定不徹底，有一定幾率殘留核酸酶，降解核酸

7)凍融組織： 組織凍存后，一旦凍融，核酸降解概率大于 80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。請各位老師送樣前注意組織保存狀態(tài)， 確保組織未發(fā)生過凍融情況

8)帶血組織：由于血液沒有專業(yè)的保護劑，去除不凈一起速凍送樣會影響組織的完整性

9)長年保存的組織：保存時間超過一年的組織不建議送樣

10)組織分離要求：正常組織樣本中不能含有病變組織，而病變組織樣本中也不可以夾帶有正常組織，提取實驗時無法精確取樣，無法稱重。組織量過多的不能全部取樣，只隨機選取適量組織提取

11)對于同一個組織樣品需要同時提取 DNA和 RNA 的，請務必分成兩管分批次送樣。樣本的特殊處理包括：鹽處理、溫度處理、藥物處理、病毒侵染、傷害處理、干旱處理等脅迫處理方式，不同程度的處理對樣本的核酸質量會造成不同程度的影響，常見的會導致核酸 的降解或者得率降低。因此，經過特殊處理的樣本，在送樣時，務必請在樣本信息單中進行詳細的備注，以便盡量提高提取的成功率和避免樣本的浪費

6、不合格樣品存在風險

6.1樣本總量不足、濃度過低存在風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足

3)導致數(shù)據(jù)隨機性異常

4)數(shù)據(jù)質量差

6.2降解樣本風險

1)文庫構建失敗

2)文庫產量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足

3)導致數(shù)據(jù)隨機性異常

4)數(shù)據(jù)質量差

5)導致數(shù)據(jù)duplication比例高、隨機性差

6)導致Small RNA rRNA比例高，影響有效數(shù)據(jù)，文庫片段異常

6.3蛋白或其他雜質污染

1)可能影響Small RNA電泳分離，造成切膠不準，影響問題質量

2)可能影響RNA-seq磁珠分離導致建庫失敗，或即使達到上機要求也可能導致文庫隨機性差等問題

3)文庫構建失敗

4)文庫產量低不能上機測序或測序數(shù)據(jù)量不足

6.4目標RNA含量低

1)總RNA達到要求，但由于樣本特異性，small RNA含量低于正常樣本，導致建庫失敗

2)總RNA達到要求，但由于處理或組織部位的特異性，mRNA降解或含量低，導致建庫失敗或者測序數(shù)據(jù)中rRNA 數(shù)據(jù)比例高