非靶向代謝組學(xué)助力癌癥Biomarker的發(fā)現(xiàn)

代謝組學(xué)是定量描述生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律的科學(xué)，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后提出的一門新的學(xué)科。代謝組學(xué)是對生物體在某一特定時期（如：病理生理刺激、不同發(fā)育狀態(tài)等），體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定性與定量分析。其研究對象大多是相對分子質(zhì)量小于1000 Da（或者1500 Da）的內(nèi)源性小分子，包括：膽固醇、脂類、氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸等等。

代謝組學(xué)在癌癥疾病中廣泛應(yīng)用。癌癥代謝組學(xué)研究的核心焦點是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)。非靶向代謝組學(xué)已被用于鑒定有意義的腫瘤標(biāo)志物，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多潛在的標(biāo)志物，用于在不同階段診斷和預(yù)測多種類型的癌癥。非靶向代謝組學(xué)無偏向地檢測樣本中所有能檢測到的代謝物分子，是通過生信方法進(jìn)行差異分析和通路分析，尋找生物標(biāo)志物，初步建立模型或代謝物Panel法。例如，在腎癌的早期診斷中，由于尿液和腎臟的密切的相互作用，研究人員使用代謝組分析癌癥和健康尿液樣品，發(fā)現(xiàn)?；鈮A，喹啉酸，4-羥基苯甲酸，和龍膽有積累。在結(jié)直腸癌中，癌癥患者和正常對照的血清樣品的代謝譜分析讓四個代謝物（2-羥基丁酸鹽，天門冬氨酸，犬尿氨酸的選擇，以及胱胺）可以作為早期診斷模型的基礎(chǔ)。關(guān)于生物標(biāo)志物，代謝組學(xué)在在肝癌，乳腺癌，卵巢癌等癌癥中都有應(yīng)用。

今天通過文獻(xiàn)來見證一下非靶代謝組學(xué)在癌癥研究中的非凡效果，認(rèn)識非靶代謝組在癌癥中尋找標(biāo)志物的重要性。

文獻(xiàn)一

從組織中篩選肝癌診斷標(biāo)志物

材料與方法：

研究材料：組織以及血液樣本

研究方法：非靶代謝組學(xué)+靶向代謝組學(xué)；內(nèi)部驗證+外部驗證

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：

1）發(fā)現(xiàn)階段-標(biāo)志物初篩

利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對50例肝癌患者的癌組織（HCT）與近端癌旁組織(ANT)以及遠(yuǎn)端癌旁組織(DNT)組織樣本中的代謝物進(jìn)行LC-MS檢測分析，通過多元變量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)癌組織與近端以及遠(yuǎn)端癌旁組織樣本之間區(qū)分明顯（圖1），即癌組織與近端以及遠(yuǎn)端癌旁組織的代謝表型差異顯著。

對檢測到的代謝物，進(jìn)行差異篩選，篩選得到105個顯著性差異的代謝物，通過注釋分析發(fā)現(xiàn)這些差異篩選到的差異代謝物主要是脂肪酸、氨基酸、糖、膽汁酸、磷脂等物質(zhì)，通過KEGG代謝通路分析表明差異代謝物主要是參與糖酵解通路、TCA循環(huán)、氨基酸代謝以及脂肪酸代謝通路，表明腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更加旺盛的能量需求。

2）血液樣本的再篩-標(biāo)志物確認(rèn)

為了更一步分析癌組織與癌旁組織篩選到的差異物是否具有作為臨床診斷的潛力，對血液樣本進(jìn)行非靶代謝組學(xué)分析，尋找在組織和血液中共有的在組織樣本差異表達(dá)的代謝物。從血液和組織樣本的共同差異代謝物中初篩標(biāo)志物。為了從差異物中找到可以與AFP互補(bǔ)的標(biāo)志物，與常用的肝癌診斷標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）進(jìn)行相關(guān)性分析，在差異物與血漿中的AFP進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析（Pearson correlation analysis），找到了8個與AFP不相關(guān)的差異物。8個候選的診斷標(biāo)志物中進(jìn)一步通過篩選到了2個候選診斷標(biāo)志物（甜菜堿、丙酰肉堿）。如下圖所示，這兩個標(biāo)志物在肝癌患者中的相對表達(dá)量顯著下調(diào)，組合在一起能夠?qū)Ω伟┖吐愿尾。?98例樣本）能夠進(jìn)行良好的區(qū)分（ ROC AUC=0.982），明顯優(yōu)于甲氧蛋白AFP的診斷能力（ROC AUC=0.697）。

3）驗證階段-標(biāo)志物驗證

為了評價和驗證篩選出的差異物是否具有良好的診斷能力，進(jìn)行內(nèi)部驗證，即將發(fā)現(xiàn)隊列的298例樣本中的一部分樣本作為訓(xùn)練集（training set）用來構(gòu)建診斷模型，剩余的樣本作為測試集（test set）用來測試篩選出的標(biāo)志物的診斷能力。結(jié)果如圖所示：在訓(xùn)練集中，模型對慢性肝病和肝癌診斷的準(zhǔn)確性分別達(dá)到91.6%和96.8%，表明模型建立良好。在測試集中，模型對慢性肝病和肝癌診斷的準(zhǔn)確性分別達(dá)到94.2%和93.5%，表明篩選到的標(biāo)志物診斷能力良好。

內(nèi)部驗證通過之后對其他來源的樣本進(jìn)行外部靶向檢測，進(jìn)一步用來排除假陽性和評價標(biāo)志物的診斷能力。對47例（22例肝炎、22例肝癌）血液樣本中的甜菜堿、丙酰肉堿進(jìn)行靶向代謝組學(xué)檢測，結(jié)果表明甜菜堿、丙酰肉堿均在肝癌患者中呈顯著的下調(diào)，與之前的非靶測試測試結(jié)果一致，排除了假陽性。甜菜堿、丙酰肉堿組合進(jìn)行疾病診斷準(zhǔn)確率可以達(dá)到80%以上，具有臨床應(yīng)用的價值。

研究結(jié)論：

甜菜堿、丙酰肉堿組合能夠?qū)Ω闻K疾病進(jìn)行良好的預(yù)測，可以作為臨床肝癌的診斷標(biāo)志物甲胎蛋白AFP的補(bǔ)充診斷手段。

文獻(xiàn)二

從尿液中篩選肺癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物

材料與方法：

研究材料：尿液以及組織樣本

研究方法：非靶代謝組學(xué)+靶向代謝組學(xué)；內(nèi)部驗證+外部驗證

技術(shù)路線：

研究結(jié)論：

研究者收集肺癌患者和健康患者的尿液以及組織樣本，通過非靶代謝組學(xué)+靶向代謝組學(xué)，內(nèi)部驗證+外部驗證方法篩選得到這四種 NANA; cortisol sulfate; creatine riboside 和 561+代謝物與疾病的相關(guān)性，證明了它們臨床應(yīng)用的價值。

總結(jié)

這兩篇文章的研究套路是遵循非靶向分析+靶向代謝分析，內(nèi)部驗證+外部驗證的原則。

1）研究思路

非靶向代謝組分析+靶向代謝組分析：非靶向代謝組，借助于LC-MS組學(xué)的高通量分析能力獲取大量數(shù)據(jù), 適用于前期篩選潛在的標(biāo)志物;靶向代謝組學(xué)分析, 即對非靶篩選出來的特定代謝物進(jìn)行特異性檢測，適用于后期對候選標(biāo)志物進(jìn)行驗證，排除假陽性的結(jié)果。
內(nèi)部驗證+外部驗證：標(biāo)志物篩選出來后需要做進(jìn)一步的驗證和評價來斷標(biāo)志物的診斷能力。一般是通過訓(xùn)練集和測試集對發(fā)現(xiàn)隊列的進(jìn)行內(nèi)部驗證，也可以結(jié)合其他來源的樣本進(jìn)行外部驗證，動物實驗或者細(xì)胞實驗。

通過非靶加上靶向驗證的實驗設(shè)計可以使文章的邏輯更為嚴(yán)密，說服力更強(qiáng)，結(jié)論更加可靠。為臨床以后這種biomarker篩選提供好的思路，篩選得到真正有望應(yīng)用于臨床的biomarker標(biāo)志物。

2）樣本的選擇

代謝組學(xué)經(jīng)過了數(shù)十年的發(fā)展，大部分疾病的代謝譜特征都被公開報導(dǎo)了，因此如果想以此研究思路進(jìn)行疾病的篩選標(biāo)志物，那么研究疾病的選擇一定要有稀缺性（稀有疾病或樣本很難獲取的疾病或者不同疾病分型），同時要兼具一定的樣本規(guī)模（小樣本發(fā)現(xiàn)階段，大樣本進(jìn)行驗證階段）。

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參考文獻(xiàn):

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