單細(xì)胞時(shí)空組學(xué)揭開斑馬魚心臟再生的奧秘

上一次，小編帶大家一起看了兩棲動(dòng)物蠑螈神奇的斷肢再生。那么，是否有水生動(dòng)物也具有強(qiáng)大的再生能力呢？今天就為各位老師分享一篇關(guān)于斑馬魚心臟再生的單細(xì)胞&時(shí)空組學(xué)文章。

發(fā)表期刊：Nature Genetics

發(fā)表單位：柏林醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所

影響因子：41.307

發(fā)表時(shí)間：2022.07.21

DOI號(hào)：10.1038/s41588-022-01129-5

研究背景

成年哺乳動(dòng)物的心臟損傷通常會(huì)導(dǎo)致永久性瘢痕。然而，成年斑馬魚心臟損傷后能有效再生，這使得斑馬魚成為研究心臟再生細(xì)胞和分子機(jī)制的理想模型。在模擬心肌梗塞的低溫?fù)p傷后，受傷的斑馬魚心臟會(huì)經(jīng)歷一個(gè)短暫的纖維化期。在此期間，受損的心肌會(huì)通過去分化和增殖進(jìn)行再生，這與心肌梗死的某些方面相似。然而，在以往的斑馬魚心臟再生研究中，還沒有系統(tǒng)的數(shù)據(jù)來確定再生細(xì)胞的狀態(tài)和細(xì)胞類型的起源，對(duì)再生生態(tài)位的細(xì)胞組成、潛在的信號(hào)傳遞和相互作用的認(rèn)識(shí)仍不全面。目前對(duì)活化巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的定義嚴(yán)重依賴于轉(zhuǎn)基因，可能受到觀察偏差的影響，從而低估斑馬魚心臟再生過程中細(xì)胞狀態(tài)的復(fù)雜性。

材料方法

單細(xì)胞RNA-seq ：

空間轉(zhuǎn)錄組（Tomo-seq）：斑馬魚心房和心室一共100張切片，每張切片分別做RNA-seq

方法：scRNA-seq、Tomo-seq、熒光原位雜交和基于CRISPR-Cas9技術(shù)的譜系追蹤

研究結(jié)果

1. 再生心臟的細(xì)胞組成

為了系統(tǒng)地識(shí)別健康和再生斑馬魚心臟中的細(xì)胞類型，作者對(duì)損傷前后不同階段的大約20萬個(gè)解離細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq（圖1a）。為了準(zhǔn)確得到細(xì)胞發(fā)育起源的相關(guān)信息，作者還應(yīng)用了一種基于CRISPR–Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法，通過注射Cas9和針對(duì)多拷貝轉(zhuǎn)基因(斑馬魚系中的dTomato：一種用于斑馬魚細(xì)胞追蹤和譜系分析的多光譜細(xì)胞標(biāo)記)的sgRNA，創(chuàng)建了作為譜系條形碼的“遺傳疤痕”來記錄早期發(fā)育中的譜系關(guān)系。

作者首先評(píng)估了健康和再生心臟中的細(xì)胞類型多樣性，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的聚類分析顯示了所有主要的心臟細(xì)胞類型。正如預(yù)期的那樣，觀察到成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞在損傷后強(qiáng)烈增加（圖1b）。進(jìn)一步檢查聚類數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，心臟的三個(gè)主要層:心外膜、心肌和心內(nèi)膜的細(xì)胞類型之間存在一個(gè)亞結(jié)構(gòu)。作者假設(shè)，由于心房和心室中這些細(xì)胞類型的功能差別，這種細(xì)胞類型的亞結(jié)構(gòu)可能存在空間差異。于是使用Tomo-seq方法（一種用冷凍切片機(jī)沿感興趣的軸對(duì)組織進(jìn)行切片，然后在每個(gè)切片上進(jìn)行RNA-seq的技術(shù)）進(jìn)行空間分辨率轉(zhuǎn)錄組，并將空間數(shù)據(jù)解卷積為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜，可以驗(yàn)證一些細(xì)胞亞型在心房和心室富集（圖1c）。之后再通過物理分離心房和心室，使用scRNA-seq證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（圖1d）。

圖1?再生心臟的細(xì)胞組成

2. 心臟成纖維細(xì)胞的細(xì)胞類型多樣性

作者進(jìn)一步確定了心肌細(xì)胞中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄亞結(jié)構(gòu)（圖2a）。除了以表達(dá)ATP合成和三羧酸循環(huán)相關(guān)基因(atp5pd和aldoaa)為特征的成年心肌細(xì)胞外，還檢測(cè)到一個(gè)較小的與心肌細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因簇(ttn.1, ttn.2,?bves and synpo2lb)，以及nppa——此前已被證明是邊界區(qū)去分化心肌細(xì)胞的標(biāo)記基因。這些去分化心肌細(xì)胞是心臟再生的標(biāo)志，其數(shù)量在3 d.p.i.（受傷后天數(shù)）增加了(圖2a)，并與已建立的標(biāo)記基因nppa22部分共定位于7 d.p.i.。

作者注意到心臟再生中三個(gè)成熟的信號(hào)因子在成纖維細(xì)胞中高度富集:合成視黃酸的酶aldh1a2、心肌細(xì)胞有絲分裂原nrg1和再生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)因子fn1a（圖2b）。為了更詳細(xì)地研究心臟成纖維細(xì)胞的多樣性，作者對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行了亞群聚類。結(jié)果顯示出驚人的多樣性，有13個(gè)轉(zhuǎn)錄上不同的成纖維細(xì)胞聚類(圖2c)。這13個(gè)基因簇在ECM相關(guān)基因的表達(dá)譜上表現(xiàn)出明顯的差異（圖2d），但它們的轉(zhuǎn)錄組多樣性遠(yuǎn)不止于此——去除ECM相關(guān)基因后，可以高精度鑒定相同的成纖維細(xì)胞亞型。

3. 心臟再生成纖維細(xì)胞的鑒定

為了集中分析那些可能是再生生態(tài)位一部分的成纖維細(xì)胞亞型，作者分析了損傷后細(xì)胞簇的動(dòng)力學(xué)。col11a1a、col12a1a和nppc特征表達(dá)的3簇成纖維細(xì)胞在再生高峰期短暫出現(xiàn)?(3、 7 d.p.i.)，但在受傷前和再生完成后幾乎不存在。由于其短暫性，作者將這三個(gè)基因簇稱為細(xì)胞狀態(tài)，而不是細(xì)胞類型（圖3a）。為了對(duì)鑒定的成纖維細(xì)胞進(jìn)行空間分辨，作者進(jìn)行了熒光原位雜交證實(shí)了瞬時(shí)成纖維細(xì)胞狀態(tài)在邊界區(qū)以及損傷區(qū)的位置（圖3b）。之后發(fā)現(xiàn)nrg1在col12a1a成纖維細(xì)胞中特別高的表達(dá)，而fn1a幾乎只在col11a1a成纖維細(xì)胞中表達(dá)（圖3c）。作者推斷瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的潛在再生功能可能是由分泌因子驅(qū)動(dòng)的。生物信息學(xué)分析顯示，與未損傷的對(duì)照組心臟相比，再生心臟的分泌組基因表達(dá)在3 d.p.i.和7 d.p.i.時(shí)增加（圖3d）。col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞中分泌組基因的表達(dá)在所有檢測(cè)到的細(xì)胞簇中最高，且其分泌組基因包含在再生、形態(tài)發(fā)生和組織發(fā)育等方面具有功能的基因（圖3e）。

雖然作者對(duì)單細(xì)胞基因表達(dá)譜的時(shí)空分析強(qiáng)烈表明了瞬時(shí)成纖維細(xì)胞的再生功能，但還需要額外的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一假設(shè)。為了從功能上評(píng)估瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞的作用，作者使用硝基還原酶/甲硝唑（NTR/MTZ）系統(tǒng)進(jìn)行靶向細(xì)胞剔除。在MTZ處理后的轉(zhuǎn)基因系Tg(-4kbcol12a1a:GAL4VP16;UAS:NTR:RFP)中，在7 d.p.i.時(shí)相較于對(duì)照，5 / 6的心臟顯示心肌細(xì)胞增殖減少，col12aa表達(dá)細(xì)胞減少（圖3g,h）。在30d.p.i.時(shí)，col12a1⁺細(xì)胞剔除顯著損害心臟再生（圖3i,j）?？傊髡叽_定了心臟再生過程中具有潛在再生作用的三種成纖維細(xì)胞狀態(tài):col11a1a、col12a1a和nppc成纖維細(xì)胞。基因細(xì)胞剔除數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明col12a1a表達(dá)細(xì)胞在再生生態(tài)位中發(fā)揮了作用。

4. 心外膜成纖維細(xì)胞的鑒定

接下來，作者想要闡明短暫成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，以便更好地理解它們的激活機(jī)制。于是作者使用了基于CRISPR-Cas9技術(shù)的大規(guī)模平行譜系追蹤方法LINNAEUS。這種方法將細(xì)胞通過可遺傳的DNA條形碼(遺傳疤痕)標(biāo)記，它們由Cas9在早期發(fā)育過程中產(chǎn)生，其獨(dú)特的序列能夠識(shí)別疤痕產(chǎn)生時(shí)來自同一親本的細(xì)胞。通過對(duì)同一個(gè)單細(xì)胞的遺傳疤痕和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，作者便可以建立譜系樹，揭示這些細(xì)胞類型的共同發(fā)育起源（圖4a）。在譜系樹中，一個(gè)節(jié)點(diǎn)中的所有細(xì)胞共享相同的發(fā)育祖先（比如圖4a，B和C節(jié)點(diǎn)就共享相同發(fā)育祖先A），并且每個(gè)節(jié)點(diǎn)上不同瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)下的每個(gè)細(xì)胞均可在相同的上一節(jié)點(diǎn)中對(duì)應(yīng)找到（比如在圖4a的譜系圖中節(jié)點(diǎn)C就包含了3種瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，這三種狀態(tài)下的所有細(xì)胞均可以在上一節(jié)點(diǎn)的對(duì)應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)中找到）。作者還計(jì)算了不同樹節(jié)點(diǎn)中細(xì)胞類型比率之間的相關(guān)性，以確定哪些細(xì)胞類型通過譜系相關(guān)聯(lián)（圖4b）。譜系相關(guān)性聚類熱圖顯示，在3 d.p.i.時(shí)有4簇細(xì)胞類型，在7 d.p.i.時(shí)有7簇細(xì)胞類型。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，所有的免疫細(xì)胞共享一個(gè)相同的譜系。此外，幾種成纖維細(xì)胞：col11a1a、col12a1a和構(gòu)成型成纖維細(xì)胞，它們和心外膜細(xì)胞聚集在一起，這表明這些成纖維細(xì)胞與心外膜細(xì)胞具有共同的發(fā)育起源（圖4c,d）。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，作者又構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系TgBAC(tcf21:Cre-ERT2;ubi:Switch)。重組后，在7 d.p.i.表達(dá)的mCherry與內(nèi)源性表達(dá)的col12a1a共定位（圖4e），證實(shí)了瞬時(shí)col11a1a和col12a1a成纖維細(xì)胞為心外膜或心外膜衍生成纖維細(xì)胞的起源。為了進(jìn)一步闡明短暫心外膜成纖維細(xì)胞狀態(tài)的起源，作者應(yīng)用了RNA速度分析方法，對(duì)心外膜譜系簇中所有心室細(xì)胞類型在3 d.p.i.和7 d.p.i.下的發(fā)育軌跡進(jìn)行推斷（圖4f），得到了相同的結(jié)論。

5. 心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的鑒定

瞬時(shí)nppc成纖維細(xì)胞和其他幾個(gè)成纖維細(xì)胞亞型(spock3、cfd和瓣膜成纖維細(xì)胞)在3 d.p.i.或7 d.p.i.時(shí)不屬于心外膜譜系，但與心內(nèi)膜以及彼此之間顯示中度正相關(guān)。基于相關(guān)性的分析有一個(gè)潛在的假設(shè)，即所有克隆體都會(huì)表現(xiàn)出相似的轉(zhuǎn)換率（圖5a），但是這種假設(shè)并不適用于所有細(xì)胞類型，于是作者引入條件概率開發(fā)了第二種算法（圖5b）。在3 d.p.i.時(shí)，不同成纖維細(xì)胞類型：col11a1a成纖維細(xì)胞、構(gòu)成型成纖維細(xì)胞、心外膜(心室)轉(zhuǎn)變?yōu)?em>col12a1a成纖維細(xì)胞類型的條件概率均大于0.9（圖5c）。在7 d.p.i. 時(shí)，不同的心內(nèi)膜細(xì)胞類型：心內(nèi)膜（心房）、心內(nèi)膜（心室）和心內(nèi)膜 ( frzb )轉(zhuǎn)變?yōu)?em>nppc成纖維細(xì)胞的條件概率均大于0.8，表明這種成纖維細(xì)胞類型與心內(nèi)膜之間存在譜系關(guān)系。為了驗(yàn)證算法的真實(shí)性，作者構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因系Tg(fli1:Cre-ERT2; hsp70l:Switch)。在7 d.p.i.表達(dá)的EGFP與內(nèi)源性表達(dá)的nppc共定位（圖5e），證實(shí)了瞬時(shí)nppc成纖維細(xì)胞的心內(nèi)膜起源。RNA速度分析揭示了心室內(nèi)膜和nppc成纖維細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄相似性和潛在的過渡路徑（圖5f）。從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中觀察到，與健康對(duì)照組心臟相比，心內(nèi)膜在7 d.p.i.時(shí)發(fā)生了激活反應(yīng)（圖5g）。

6. 典型Wnt信號(hào)通路作用的細(xì)胞解剖

作者發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中表達(dá)了許多與Wnt信號(hào)有關(guān)的基因(配體、受體和調(diào)節(jié)劑)（圖6a），于是這啟發(fā)了他們?nèi)パ芯縒nt信號(hào)在斑馬魚心臟再生過程中的作用。一方面，Wnt通常被認(rèn)為是一種促增殖因子，Wnt的激活已被證明對(duì)斑馬魚鰭和脊髓再生有益。另一方面，Wnt信號(hào)通路在心肌細(xì)胞去分化和增殖中的作用存在爭(zhēng)議。于是，作者在斑馬魚心臟冷凍損傷后，使用特征良好的Wnt/β-catenin依賴的信號(hào)抑制劑IWR-1抑制典型的Wnt信號(hào)，并在3,7,15和30 d.p.i.觀察其影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制導(dǎo)致心臟再生顯著延遲，與對(duì)照組相比，心肌纖維化延長，損傷面積增大（圖6b）。IWR-1處理后心臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示心肌細(xì)胞去分化延遲，與對(duì)照組相比，去分化心肌細(xì)胞數(shù)量在3 d.p.i.時(shí)減少，而在7 d.p.i.時(shí)未定位于損傷區(qū)域（圖6c）。Wnt抑制后，血管周細(xì)胞和所有心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞(nppc、spock3和瓣膜成纖維細(xì)胞)的水平顯著降低，而其他短暫增加的成纖維細(xì)胞總體上保持在類似水平（圖6d）。通過熒光原位雜交也證實(shí)了，Wnt信號(hào)對(duì)于心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞的激活是必需的，類似于所描述的Wnt在誘導(dǎo)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。

為了評(píng)估血管再生，作者對(duì)4d.p.i.下冠脈內(nèi)皮細(xì)胞(cECs)的增殖以及7 d.p.i.損傷區(qū)冠狀動(dòng)脈的覆蓋范圍進(jìn)行了定量分析。發(fā)現(xiàn)注射IWR-1后，cEC增殖在4 d.p.i.時(shí)有邊緣但不顯著的下降（圖6f,g）。然而，在7d.p.i.時(shí)，損傷區(qū)冠狀動(dòng)脈覆蓋明顯減少（圖6h,j）。這些結(jié)果表明，Wnt抑制后觀察到的心臟再生減少至少部分是由血管再生缺陷介導(dǎo)的。這種缺陷似乎不是由cECs增殖減少引起的，而可能與血管再生的其他方面有關(guān)。

圖6 對(duì)典型Wnt信號(hào)作用的細(xì)胞剖析

總? 結(jié)

成年斑馬魚心臟損傷后具有很高的再生能力。然而，再生生態(tài)位的組成在很大程度上仍然難以捉摸。這篇文章基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和時(shí)空分析，解剖了再生斑馬魚心臟中激活細(xì)胞狀態(tài)的多樣性。觀察到損傷后出現(xiàn)的幾種具有成纖維細(xì)胞特征的瞬時(shí)細(xì)胞狀態(tài)，并概述了表達(dá)膠原-12的成纖維細(xì)胞的促再生功能。為了了解導(dǎo)致心臟再生的級(jí)聯(lián)事件，作者通過高通量譜系追蹤確定了這些細(xì)胞狀態(tài)的起源。最終發(fā)現(xiàn)激活的成纖維細(xì)胞有兩個(gè)不同的來源:心外膜和心內(nèi)膜。在機(jī)制上，確定Wnt信號(hào)作為心內(nèi)膜成纖維細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)器?？傊?，本文確定了促進(jìn)心臟再生的特殊活化成纖維細(xì)胞狀態(tài)，從而為調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物心臟再生能力開辟了可能的途徑。

 

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參考文獻(xiàn)

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