本研究使用一組基因敲除的人類胚胎干細胞（ESC）系，利用二代和nanopore三代DNA甲基化測序技術(shù)，分析了DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶reader和DNA去甲基化酶eraser對DNA甲基化景觀的獨立和組合影響。比較了14種不同的人ESC品系野生型（WT）和敲除型的全基因組甲基化水平，發(fā)現(xiàn)TET酶被集中招募到整個基因組中成千上萬的體細胞增強子，但是只要存在DNMT3，TET酶就在多能細胞中保持高度甲基化。TETs在整個基因組中也具有更廣泛的活性，需要DNMT3表達來維持穩(wěn)態(tài)甲基化水平?？傊?，不同類別的酶在基因組局部和整體是競爭關(guān)系。
研究背景
哺乳動物基因組通常顯示高水平的CpG甲基化，除了大多數(shù)CpG密集的啟動子區(qū)域，以及某些在發(fā)育上重要的增強子區(qū)域。體細胞DNA甲基化態(tài)勢總體穩(wěn)定地傳播，而與衰老和疾病相關(guān)的全局模式發(fā)生了變化。相反，細胞分化過程中CpG甲基化的發(fā)育調(diào)節(jié)通常反映了對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的局部重編程。
從頭DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B負責(zé)添加甲基以生成5-甲基胞嘧啶（5mC），而DNMT1則主要用于傳播預(yù)先建立的DNA復(fù)制修飾。相比之下，TET酶（TET1，TET2和TET3）氧化5-甲基胞嘧啶，生成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）或進一步的氧化物，去除甲基基團。從頭甲基化和去甲基化對于正常發(fā)育都是必不可少的，敲除會導(dǎo)致胚胎或產(chǎn)后早期致死。每種酶似乎發(fā)揮特定角色作用，例如，DNMT3B優(yōu)先募集到衛(wèi)星重復(fù)序列和轉(zhuǎn)錄活躍基因；DNMT3A似乎在低甲基化增強子的周圍，被稱為“峽谷”的延伸的低甲基化結(jié)構(gòu)域和發(fā)育平衡的啟動子上，TET1和TET2起相反作用以維持低甲基化狀態(tài)；TET2可能還具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸的功能。
尚無研究直接比較喪失所有去甲基酶和甲基轉(zhuǎn)移酶化對轉(zhuǎn)錄和基因組調(diào)控以及細胞活性的影響。為了檢查去除所有DNA甲基化活性調(diào)節(jié)蛋白的分子后果，作者生成了在DNMT3A和-3B以及所有3個TET蛋白均缺失的五元敲除（ pentuple-knockout，PKO）人類ESC進行相關(guān)研究。
研究方法
構(gòu)建DNMT 2個蛋白和TET 3個蛋白分別敲除或共敲除的人胚胎干細胞系ESC；
二代WGBS：檢測CpG甲基化水平以及與WT相比分析差異甲基化區(qū)域DMR，鑒定DNMT3A/3B敲除ESC中保守的DMR：c-DKO-DMR；TET敲除ESC中c-DKO-DMR分析；TET敲除后重新過表達TET分析甲基化水平；小鼠ESC相關(guān)細胞系檢測甲基化分析保守性；
nanopore三代DNA測序分析甲基化和結(jié)構(gòu)變異SV：評估純合L1Hs元件DNA全長序列甲基化狀態(tài)；
全基因組氧化亞硫酸氫鹽測序（oxBS）分析5hmC甲基化修飾；
ENCODE和其他公開發(fā)表chip-seq數(shù)據(jù)分析組蛋白修飾等染色體分布；其他已發(fā)表甲基化數(shù)據(jù)輔助分析；
DKO細胞RNA-seq ?分析c-DKO-DMR與基因表達關(guān)系；
hairpin亞硫酸氫鹽測序分析是否雙鏈對稱甲基化；
研究結(jié)果
1.DNMT3缺失時TET驅(qū)動基因組全局去甲基化
圖1上
2.多能細胞中DNMT和TET之間的局部競爭
為了進一步研究這種甲基化缺失，接下來從另一個人類ESC系（HUES64）（包括2個獨立的DKO克隆（A和B））WT和DKO細胞進行了甲基化測序，并將甲基化水平與先前衍生的18個單DNMT3A-/-（3AKO）和單DNMT3B-/-（3BKO）敲除數(shù)據(jù)作比較（圖1b）。兩種不同的雄性WT ESC似乎具有可比性，具有相似的整體甲基化平均值（HUES64，0.79；HUES8，0.78），并且在1kb分辨率上具有較高的相關(guān)性（Pearson系數(shù)=0.93）。有趣的是，盡管第22代的單DNMT3基因敲除仍保持高度甲基化（3AKO，0.81；3BKO，0.79），但2個HUES64 DKO克隆僅經(jīng)過3代后甲基化降低至0.70（圖1b）。當(dāng)我們以堿基對的分辨率檢查數(shù)據(jù)時，觀察到2個不同的動態(tài)類別：0.1-0.2的細微下降，影響了整個基因組范圍內(nèi)約10％的CpG，以及，在CpG島內(nèi)局部發(fā)生的甲基化幾乎完全喪失的CpG位點（圖1c）。使用嚴格的標準（甲基化差異> 0.6，P <0.01，F(xiàn)檢驗）來定義差異甲基化區(qū)域（DMR）。DKO-DMR在3個DKO譜系上都非常一致（圖1c，d）。因此，定義了在所有3個樣品中均被甲基化的“一致性”的11,430個cDKO-DMR，cDKO-DMR始終保持較低水平（平均WT，0.749；DKO，0.086），平均長度為688個堿基對（bp）。WT ESC中大約三分之一cDKO-DMR鄰近低甲基化區(qū)域，例如CpG島和轉(zhuǎn)錄起始位點（稱為“1類”），而其余的cDKO-DMR則位于其他高度甲基化的區(qū)域（內(nèi)含子或基因間），具有明顯的高甲基化邊界（稱為“第2類”；圖1e–h）。幾乎所有的cDKO-DMR（93％）都被DNMT3A或-3B甲基化，僅在DKO中被完全去甲基。
圖1下
由于這些結(jié)果強烈暗示了一種主動的去甲基化機制，作者研究了在TET敲除的HUES8細胞系（TKO，QKO和PKO）中cDKO-DMR的甲基化水平。在沒有TET的情況下，先敲除DNMT3B，然后再敲除DNMT3A，不會導(dǎo)致cDKO-DMR去甲基化（圖1i）。即使經(jīng)過20次傳代，PKO細胞中cDKO-DMR甲基化水平也僅微弱下降。此外，在TKO細胞中，許多1類cDKO-DMR周圍的區(qū)域獲得了甲基化，這進一步暗示了局部去甲基化過程中的TET活性。總之，人類多能性細胞中有一些依賴于DNMT3A或-3B的獨特且高度甲基化的區(qū)域，這些區(qū)域在缺少它們的情況下會經(jīng)歷快速的TET介導(dǎo)的去甲基作用。
3.TET在cDKO-DMR處顯示持續(xù)的活性
為了驗證cDKO-DMR是否依賴并持續(xù)誘導(dǎo)TET活性，利用PiggyBac轉(zhuǎn)座將外源TET1（短isoform簡稱TET1s）、TET2和TET3重新引入PKO細胞中，并使用WGBS測量了總體甲基化水平（圖2a）。在異位表達每種蛋白質(zhì)后，PKO細胞的總體平均甲基化水平從第20代的0.73明顯降低到了異位表達每種蛋白質(zhì)后的0.61、0.59和0.54，而僅用轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)染的對照細胞保持穩(wěn)定（平均值=0.70；圖2b）。重新引入任何TET酶可在很大程度上恢復(fù)TKO細胞中異常高甲基化的區(qū)域，誘導(dǎo)快速的cDKO-DMR去甲基化（圖2c-e）。從機理的角度來看，TET1s亞型缺乏CXXC結(jié)構(gòu)域，無法募集至未甲基化的CpG密集區(qū)域，但TET1和TET2 rescue結(jié)果之間無明顯差異，支持了CXXC結(jié)構(gòu)域無關(guān)的募集機制。TET及其作用相反的酶在cDKO-DMRs上的持續(xù)動態(tài)也得到了已發(fā)表的染色質(zhì)免疫沉淀的支持，隨后進行ChIP-seq，該數(shù)據(jù)表明WT ESC中DNMT3B和TET1均富集，盡管富集在比相當(dāng)狹窄且定義明確的cDKO-DMR邊界更寬區(qū)域。最后，進行了全基因組氧化亞硫酸氫鹽測序（oxBS），并在WT細胞中發(fā)現(xiàn)了5hmC的顯著局部富集（平均cDKO-DMRs，0.07；背景，0.01；圖2f）。
圖2
綜上所述，這些結(jié)果證實，TET酶被持續(xù)招募到整個基因組中成千上萬個基因座，并且如果不存在DNMT3活性，則可以指導(dǎo)快速、局部去甲基化。
4.進化上年輕的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中動態(tài)募集DNMT-TET
cDKO-DMR改變穩(wěn)健而√確地改變其甲基化狀態(tài)方式表明它們可能與調(diào)控元件重疊。一個小的子集包括L1Hs或L1PA長散布的核元件（LINEs）的5’非翻譯區(qū)（UTR），它們充當(dāng)其功能啟動子，DNMT3敲除后通常顯示出進化年齡和CpG密度依賴性去甲基（圖3a，b）。這些區(qū)域在WT ESC中還顯示出高于預(yù)期的5hmC富集，支持連續(xù)的TET募集（圖3b）。為了進一步研究，專注于人類特異性的L1Hs元件，并使用牛津納米孔的MinION平臺生成長reads（平均長度=8.9kb），從而能夠z確比對和評估HUES64 ESC WT和DKO，以及HUES8 ESC WT，TKO和PKO的LINE特異性甲基化狀態(tài)。（用nanopolish檢測了甲基化以及sniffle軟件分析SV，sniffile鑒定到的L1Hs元件有純合、雜合或缺失，只有純合且長度至少為6kb的用于后續(xù)分析。）在野生型細胞中，7％的L1Hs 5’UTR（每個樣品中全長覆蓋reads條數(shù)為207）已經(jīng)被低甲基化（圖3c）。盡管經(jīng)常沒有通過嚴格的DMR判斷標準，但在DNMT3A和DNMT3B敲除后91％的WT甲基化元件被去甲基（圖3c）。去甲基化依賴于TET表達，只有一小部分在PKO細胞中顯示丟失（圖3c）。根據(jù)它們的甲基化動力學(xué)劃分單個LINE后，無法查明與甲基化狀態(tài)一致的任何單核苷酸多態(tài)性，這表明DNMT/TET募集背后的機制更為復(fù)雜。值得注意的是，在DKO ESC中保持甲基化的17個L1Hs 5’UTR具有較低的CpG密度和GC含量，這可能表明較高的CpG密度有利于TET募集和去甲基化。似乎LINE 5’UTR對DNMT3/TET表達高度敏感并且可以快速切換甲基化狀態(tài)，甲基化狀態(tài)對于表達DNMT3的多能細胞中的大多數(shù)元件都是有利的。
圖3
5.體細胞增強子被多能細胞中的DNMT3和TET活性靶向
盡管TET可以募集到LINE 5’UTR，但它們更頻繁地定位于啟動子或活性增強子，使它們保持低甲基化狀態(tài)。的確，有7％的cDKO-DMR與低甲基化的活性增強子相鄰，支持了先前的證據(jù)表明DNMT3s保護了增強子的邊界免受擴展的低甲基化作用（圖3a，d，e）?？紤]到TETs在活性增強子中的典型作用，作者認為也可能代表僅在其他細胞狀態(tài)被激活時才經(jīng)歷去甲基化的調(diào)節(jié)元件。令人驚訝的是，有85％的cDKO-DMR與至少一種先前定義的組織特異性增強子重疊，并且在相關(guān)的細胞類型中被特異去甲基化（圖3a，f，g）。盡管cDKO-DMR幾乎總是體細胞增強子，但事實并非如此：許多體細胞增強子已經(jīng)在ESC中甲基化，在其相關(guān)組織中保持高度甲基化，或者盡管在其他發(fā)育過程中失去了甲基化，但在ESC中并未顯示出TET依賴性去甲基化（圖3h）。為了探索DMR的穩(wěn)定性，進一步傳代了HUES64 DKO克隆A細胞并進行了WGBS。在經(jīng)過28次無DNMT3活性的傳代后，鑒定到增加了59,618個DKO-DMR，其中79％與推定的組織特異性增強子重疊。在后期傳代的DKO細胞中，約有三分之一的體細胞增強子仍保持甲基化狀態(tài)。為了檢查增強子去甲基化的能力是否與發(fā)育時期相關(guān)（它們在發(fā)育過程中被激活時），利用最近發(fā)表的數(shù)據(jù)集，詳細介紹了從HUES64 ESCs到胰島分化的9個階段中增強子的激活和甲基化動力學(xué)。有趣的是，在分化的每個階段，相似比例的增強子與DKO-DMR重疊，在末端分化的階段，其頻率略高。盡管是推測性的，與ESC分化之間缺乏明顯聯(lián)系表明，一部分胚胎和成年組織特異性增強子可能以依賴于DNMT3和TET的持續(xù)和相反功能的狀態(tài)存在。
6.ESC中體細胞增強子的DNA甲基化缺失影響基因表達
作者想知道如何將TET募集到這組高度甲基化的體細胞增強子中，以及失去主動DNMT3募集的影響會是什么。cDKO-DMR具有高于背景的CpG密度（3.2％），但這尚未分類，因為大多數(shù)具有匹配CpG密度的1-kb區(qū)域在DKO細胞中不會丟失甲基化。當(dāng)在WT ESC中尋找cDKO-DMR與選定的表觀遺傳特征之間的關(guān)聯(lián)時，發(fā)現(xiàn)它們通常更富集在開放染色質(zhì)和H3K4me1富集區(qū)域，而不是H3K27ac富集區(qū)域，后者通常與參與轉(zhuǎn)錄的“活性”增強子相關(guān)（圖3i）。盡管經(jīng)常重疊，但H3K4me1富集仍然不足以預(yù)測cDKO-DMR。此外，僅約10％的富含H3K4me1的體細胞增強子也富含H3K27me3，表明不存在經(jīng)典的“平衡”染色質(zhì)狀態(tài)。盡管可以確認這些區(qū)域在分化后受到組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的束縛，但并未發(fā)現(xiàn)ESC增強子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的富集。然后，將查詢擴展到其他ESC表達的轉(zhuǎn)錄因子，包括來自WT HUES64 ESCs34的8個ChIP-seq數(shù)據(jù)集和H1 ESC細胞系ENCODE中63個ChIP-seq數(shù)據(jù)集。即使在更大的轉(zhuǎn)錄因子集上，也未在cDKO-DMR邊界內(nèi)發(fā)現(xiàn)任何明顯的富集，也未觀察到任何已知因子的一致序列基序motif。因此，TET的募集可能取決于上述集合中未包括的轉(zhuǎn)錄因子或替代策略，例如通過非編碼RNA，或者它可能涉及更復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制或相互作用，尚待闡明。
最后，探討了是否可以將DKO-DMR定位于基因并評估潛在的調(diào)控作用。平均而言，cDKO-DMR位于距轉(zhuǎn)錄起始位點48 kb處，并且可以通過接近6,594個基因進行分配，這不允許進行有意義的通路或相互作用分析。相反，進行RNA測序（RNA-seq），以識別這些體細胞增強子的甲基化缺失是否影響基因表達。實際上，晚期傳代DKO細胞與分化相關(guān)的基因顯著上調(diào)（n=2,455），例如EOMES、SOX17、TGFB2、MSX2、SOX1和SIX1。盡管無法區(qū)分是直接作用還是間接作用，但到第6代，這些基因中已有526個已經(jīng)顯示出顯著的差異表達。在第28代，與差異表達基因相關(guān)的DKO-DMR基本上更接近其基因，另外三分之二的差異表達基因與至少一種DKO-DMR相關(guān)。這些趨勢還支持了靶向調(diào)控元件的去甲基化與基因表達上調(diào)之間的潛在聯(lián)系。
7. cDKO-DMR是保守的，與多能性有關(guān)
為了探索這種局部調(diào)節(jié)的動態(tài)甲基化的保守性，在小鼠表皮干細胞（EpiSCs）中突變了Dnmt3a和Dnmt3b，因為它們代表了與人類多能細胞最接近的發(fā)育和分子類似物。在第4步對WT和DKO細胞進行了WGBS測序，并鑒定了3888個與人類DKO-DMR具有相似特性的DMR，與82％的推定體細胞增強子重疊。雖然數(shù)量、√確序列和坐標未直接在物種之間map，但小鼠DKO-DMR出現(xiàn)在非常相似的位置且與直系同源基因接近（圖4a）。因此，在體細胞增強子處甲基化轉(zhuǎn)換的機制和這些區(qū)域的調(diào)控模式都看起來非常保守。
圖4
由于體細胞也表達DNMT和TET，是否DNMT3/TET在體細胞增強子上的相互作用是多能性所獨有的，還是在分化后仍能保留？研究了發(fā)育各個階段中缺乏DNMT3活性：這些包括在血清/白血病抑制因子（LIF）中培養(yǎng)的小鼠ESC，它比EpiSC代表更幼稚的多能狀態(tài)。在大多數(shù)體細胞不表達具有催化活性的DNMT3B的前提下，還檢查了純合Dnmt3a-/-小鼠的組織，因此DNMT3A的丟失將產(chǎn)生缺乏從頭甲基轉(zhuǎn)移酶活性的“ DKO樣”細胞（圖4b）。然后，在第4代對WT和DKO ESC以及8天齡WT和Dnmt3a-/-小鼠的腦、結(jié)腸、肝和肺組織進行了WGBS（圖4b）。與EpiSCs相比，ESC的DKO-DMR多了10倍（n=63,971），而在組織中（大腦，146；結(jié)腸，511；肝臟，318；肺，252；）減少了十倍。因此，cDKO-DMR的動態(tài)調(diào)節(jié)似乎僅限于多能細胞狀態(tài)，隨著發(fā)育的進行，TET靶向基因座的數(shù)量大大減少。在每種情況下，73-82％的DMR與先前定義的小鼠組織特異性增強子重疊。體細胞Dnmt3a KO DMR優(yōu)先偏愛位于CpG島和shores附近的1類亞組，這表明在這種情況下，TET在很大程度上起到了保護未甲基化區(qū)域邊界的作用。
為了補充小鼠數(shù)據(jù)，重新分析了從HUES64 WT和DNMT3A KO人類ESC分化為有絲分裂后運動神經(jīng)元的WGBS數(shù)據(jù)，在該系統(tǒng)中，細胞在第2天失去DNMT3B的蛋白質(zhì)表達，從而在存活的3AKO細胞中產(chǎn)生DKO樣狀態(tài)。細胞在約12天內(nèi)沒有DNMT3活性，即便連續(xù)不斷地表達TET1-3但是cTKO-DMR仍保持高度甲基化，這進一步暗示了參與該過程的關(guān)鍵因素可能僅以多能狀態(tài)表達。
8.TET酶也在整個基因組中廣泛地去甲基化
在確定DNMT和TET以多能性特異性方式調(diào)節(jié)一部分體細胞增強子元件后，在DKO和PKO品系中觀察到全基因組逐漸去甲基化。為避免將總體測量結(jié)果與上述目標DNMT3或TET活性混淆，排除了任何一對樣品之間鑒定出的所有低嚴格DMR（n=238,497）。作為所有體細胞增強子區(qū)域。值得注意的是，在存在或不存在TET的情況下，DNMT3的丟失仍然導(dǎo)致每次傳代的總體平均甲基化降低分別為0.0028和0.0037（圖5a）。隨后，估計每個細胞周期DNA甲基化模式的保真度為99.75和99.64（估計每傳代6天和每傳代4天，DKO和PKO細胞的群體倍增時間，細胞在培養(yǎng)條件下生長時其數(shù)目倍增所需的時間，分別為28.8h和24h）。
異染色質(zhì)內(nèi)的甲基化缺失被認為是由于低DNMT1保真度和有絲分裂所致。為了支持該模型，觀察到了僅表達DNMT1的PKO細胞在異染色質(zhì)區(qū)域內(nèi)甲基化的優(yōu)先缺失。相反，DKO細胞在常染色質(zhì)中表現(xiàn)出優(yōu)先的甲基化缺失，這暗示著來自全基因組TET活性的其他貢獻（圖5b）。低5hmC信號分布在整個WT ESC的基因組中，包括在惰性的基因間區(qū)，其在常染色質(zhì)中的含量較高（圖5b，c）。因此，當(dāng)沒有從頭甲基化的DNMT時，甲基化在WT 5hmC高的區(qū)域中減少*多（圖5d，e）。
圖5
將WT HUES64 ESC分化為有絲分裂后的運動神經(jīng)元，其中5hmC不能通過分裂被動稀釋，以更具體地跟蹤TET的參與度和催化活性。培養(yǎng)60天后，基因（特別是表達的基因）和基因間基因座內(nèi)富集了5hmC水平，其中*大的增加發(fā)生在惰性染色質(zhì)內(nèi)，支持了TET的廣泛氧化（圖5f，g）。因此，TET通過運動神經(jīng)元以及ESC的基因組保持了廣泛氧化甲基胞嘧啶的能力。
通常，如果不被DNMT3A或DNMT3B抵消，這種活性將導(dǎo)致胞嘧啶修飾的連續(xù)轉(zhuǎn)換和整體甲基化的降低。在這種范式下，人們可能會期望ESC在TET丟失后顯示出整體甲基化增加，因為這將使平衡向DNMT3活性轉(zhuǎn)移。與期望相反，并且如先前在癌細胞中所指出的，與匹配的WT相比，在缺乏TET的細胞中也觀察到了輕微的下降。與WT相比，這可能與TKO細胞的生長速率增加有關(guān)，這也可能影響甲基化維持。
為了解DNMT和TET的競爭活性是否有助于甲基化異質(zhì)性，如先前懷疑的富含H3K4me1的增強子區(qū)，進行了hairpin亞硫酸氫鹽測序，以測量同一分子CpG二聚體上對稱的胞嘧啶甲基化。在沒有從頭DNMT和TET的情況下，發(fā)現(xiàn)了較少的半甲基化二倍體（PKO中為4.48％，WT細胞中為8.89％），這表明DNMT和TET共同作用以在單個基因座上產(chǎn)生表觀遺傳變異。（在哺乳動物中，DNA甲基化通常以對稱的方式出現(xiàn)在CpG核苷酸中，即如果一個CpG上的一個胞嘧啶(C)出現(xiàn)甲基化，那么其互補鏈上的相應(yīng)胞嘧啶(C)也會被甲基化）。全基因組TET活性的隨機性似乎會在細胞群體內(nèi)產(chǎn)生甲基化異質(zhì)性。
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