近日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所在Food Research International （IF=5.0）雜志發(fā)表了Caffeic acid prevents non-alcoholic fatty liver disease induced by a high-fat diet through gut microbiota modulation in mice一文，探討了咖啡酸在小鼠腸道中對微生物菌群的影響，從而為非酒精性脂肪性肝病的預(yù)防提出新的見解理論基礎(chǔ)。其中微生物多樣性檢測由百邁客協(xié)助完成。
研究背景
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全世界關(guān)注的主要健康問題;它是一種主要的隱性疾病，會增加罹患多種慢性疾病的風(fēng)險，如2型糖尿病和心血管疾病。NAFLD患者有發(fā)展為脂肪肝、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的風(fēng)險。然而，NAFLD的誘導(dǎo)和進(jìn)展的病理機制復(fù)雜，目前還沒有明確的靶向藥物。改變生活方式和改變飲食是目前緩解NAFLD的主要策略。因此，確定NAFLD的新靶點和治療方法仍然是一個挑戰(zhàn)。
NAFLD是由肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度堆積引起的，新生脂肪生成是脂肪儲存的重要途徑。肝臟脂肪生成主要由固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1 (Srebp1)調(diào)控，Srebp1增強脂肪生成基因的后續(xù)激活，包括脂肪酸合成酶(Fas)、乙酰輔酶a羧化酶(Acc)和硬脂酰輔酶a去飽和酶1 (Scd1)，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累。此外，NAFLD的發(fā)病和進(jìn)展是眾所周知的與炎癥有關(guān)。腸道衍生毒素，如脂多糖(LPS)，被認(rèn)為在肝臟炎癥中具有致病作用，并與NAFLD密切相關(guān)。一方面，有報道稱LPS可促進(jìn)Srebpl激活和肝臟脂質(zhì)積聚。相反，LPS通過激活肝臟toll樣受體4 (TLR4)/核因子-κB (NF-kB)信號通路觸發(fā)炎癥反應(yīng)。
近年來，腸道菌群與NAFLD的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。腸道微生物群產(chǎn)生促炎LPS并進(jìn)一步影響肝臟脂質(zhì)代謝，已成為NAFLD發(fā)展的重要參與者。研究表明，高脂肪飲食(HFD)喂養(yǎng)的無菌小鼠肝臟中的脂質(zhì)水平低于傳統(tǒng)飼養(yǎng)的小鼠。此外，將從高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖供體中分離出的腸道微生物移植到無菌動物中，會導(dǎo)致受體小鼠體重顯著增加和代謝綜合征。因此，腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對維持健康至關(guān)重要，確定腸道菌群的組成對于研究NAFLD與失調(diào)之間的致病關(guān)系和潛在致病聯(lián)系是必要的。
咖啡酸(CA)，也被稱為3,4 -二羥基肉桂酸，是最常見的酚酸之一，存在于大多數(shù)植物中，包括咖啡、水果和丹參。CA在人類飲食中廣泛使用。越來越多的證據(jù)證實CA具有多種生物功能，包括抗氧化和抗炎活性。與此同時,據(jù)報道,CA減少alcohol-fed老鼠的肝臟脂質(zhì)含量,抑制油的段脂肪生成人類HepG2細(xì)胞,和改善小鼠的肝脂肪變性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過增加自噬。然而，CA作用于脂質(zhì)積累的機制尚不清楚。枸杞葉提取物含有多種酚酸，包括CA，有研究表明，枸杞葉提取物可以通過調(diào)節(jié)代謝譜和腸道菌群組成來改善大鼠2型糖尿病。然而，目前尚無關(guān)于CA對NAFLD腸道菌群影響的研究報道。本研究旨在探討CA對NAFLD的降脂作用及其機制，尤其關(guān)注其對腸道菌群的影響。
英文名稱: Caffeic acidprevents non-alcoholic fatty liver disease induced by a high-fat
diet through gut microbiota modulation in mice
中文名稱: 咖啡酸通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群預(yù)防由高脂肪飲食引起的非酒精性脂肪肝
雜 志：Food Research International
影響因子：5.0
材料方法
1、實驗材料：
6周齡雄性C57BL/6J小鼠，正常鼠糧(ND, 1025)、ND添加0.08%或0.16% CA 、HFD(合成飼糧添加0.15%膽固醇，w/w, H10141)，HFD添加0.08%或0.16% 。
2、研究方法：
在ND適應(yīng)1周后，將小鼠隨機分為2組:ND組(n = 30)和HFD組(n = 30)，治療8周。
ND組小鼠隨機分為3組(n = 10)，飼喂特定飼料，為期8周。這些組包括:1)喂食正常食物的ND小鼠;2)低ND+CA，喂食CA含量為0.08%的正常鼠糧;3)高ND+CA，喂食CA含量為0.16%的正常飼料。同時，高脂飲食組按以下飼
隨機分為3組(n = 10)，飼養(yǎng)期8周。這些組包括1)高脂飲食小鼠;2) HFD+CA-low組，高脂日糧中添加0.08% CA;3) HFD+CA高組，飼喂添加0.16% CA的高脂飼糧，每2周測量體重。
最后用戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉小鼠。小鼠經(jīng)心臟穿刺采血后處死，取肝臟稱重?；啬c、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物無菌收集，立即置于- 80°C保存至使用。
研究結(jié)果
１.補充CA可降低高脂喂養(yǎng)小鼠的脂質(zhì)積累
本研究旨在評估CA治療高脂喂養(yǎng)小鼠的潛在益處，重點關(guān)注在NAFLD發(fā)病機制中，除了調(diào)節(jié)內(nèi)毒素相關(guān)炎癥信號機制和脂代謝改變外，恢復(fù)腸道菌群平衡可能與之有關(guān)。為了研究CA對脂質(zhì)積累的影響，我們分別用低濃度和高濃度的CA喂養(yǎng)小鼠。肝脂肪變性是主要的組織病理學(xué)表現(xiàn);在其他研究中觀察到，高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的肝臟比三組ND小鼠的肝臟出現(xiàn)更多的脂肪變性，宏觀上黃色和堅硬的紋理證明了這一點(圖1A)。值得注意的是，添加0.08%或0.16% CA的HFD小鼠肝臟表面呈紅褐色，質(zhì)地柔軟。肝切片HE染色(圖1B)和油紅O染色(圖1C)證實了這一點。與ND組相比，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠脂肪滴更多、更大，而CA處理的小鼠脂肪滴更少。與ND組相比，HFD干預(yù)8周后小鼠體重顯著增加，并持續(xù)增加至16周。然而，從第8周開始，飼糧中添加0.08%或0.16%的CA可以有效地緩解hfd誘導(dǎo)的體重增加，特別是在第14周(CA濃度均為)和第16周(僅添加0.08% CA)時(圖1D)。在肝臟重量(圖1E)、體重(圖1F)和肝臟/體重(圖1G)以及兩種濃度的CA處理中也可以觀察到類似的結(jié)果，這降低了hfd誘導(dǎo)的肝臟重量、體重和肝臟/體重的增加。與只喂食ND組相比，添加CA的ND組對這些指標(biāo)沒有任何差異。
圖1
2.CA的補充影響hfd喂養(yǎng)小鼠的生化標(biāo)記物
血清TC、TG、HDL-C和LDL-C升高是HFD組小鼠的主要特征。同樣，HFD組小鼠血清TC、HDL- C、LDL-C水平明顯升高，提示小鼠出現(xiàn)高脂血癥。CA處理在低和血清TC、TG、HDL-C和LDL-C升高是HFD組小鼠的主要特征。同樣，HFD組小鼠血清TC、HDL- C、LDL-C水平明顯升高，提示小鼠出現(xiàn)高脂血癥。CA處理在低和低濃度的TC、HDL-C和LDL-C對hfd誘導(dǎo)的血清高脂血癥有緩解作用。但各組間血清TG水平無顯著差異(圖2A-D)。在HFD組中，ALT、AST、葡萄糖和hsCRP水平均升高，而在喂食HFD的小鼠中，添加兩種濃度的CA只恢復(fù)了血清中ALT和葡萄糖(圖2E-H)。添加CA的ND小鼠與只添加ND的小鼠表現(xiàn)出幾乎相同的結(jié)果。
圖2
3.補充CA可調(diào)節(jié)高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪生成相關(guān)蛋白表達(dá)
Srebp1是大多數(shù)肝脂合成基因的主調(diào)控基因，包括Fas、Acc和Scd1。Fas為TG提供非酯化脂肪酸底物，導(dǎo)致脂肪酸合成和TG積累增強。Acc將乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶a，參與脂肪酸合成。Scd1有助于脂肪酸去飽和。Srebp1及其靶基因Fas、Acc和Scd1在NAFLD中上調(diào)，抑制Srebp1活性可抑制Fas、Acc、Scd1和TG的積累。接下來，我們評估了CA對高脂喂養(yǎng)小鼠新生脂肪形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。我們的結(jié)果表明，與對照組相比，HFD顯著上調(diào)了肝組織中Srebp1、Fas、Acc和Scd1的表達(dá)，而低濃度和高濃度CA的補充均不同程度地減弱了該表達(dá)。添加CA的ND小鼠與只給ND小鼠沒有明顯差異(圖3A-E)
圖3
4.補充CA可減輕高脂喂養(yǎng)小鼠的內(nèi)毒素血癥和隨后的促炎反應(yīng)
有報道稱，NAFLD的特征是腸道菌群改變、炎癥和腸道屏障破壞。肝組織炎癥被認(rèn)為是肝脂肪變性發(fā)展的驅(qū)動因素，腸道源性脂多糖被認(rèn)為在肝臟炎癥中具有致病作用。最近的動物實驗研究關(guān)注了腸道菌群LPS在NAFLD發(fā)生中的作用。腸道源性LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，通過TLR4信號通路和下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)炎癥反應(yīng)。有報道稱，在NAFLD模型中，與野生型小鼠相比，tlr4缺陷小鼠的肝損傷、炎癥和脂質(zhì)積累減少。此外，阻斷腸道菌群與宿主細(xì)胞之間的脂多糖- tlr4相互作用可以阻止高脂喂養(yǎng)小鼠NAFLD的啟動和發(fā)展，這證實了脂多糖- tlr4通路在誘導(dǎo)NAFLD中具有非常重要的作用。與之前的研究結(jié)果一致，我們的研究表明，16周高脂飲食導(dǎo)致血清LPS和肝臟TLR4表達(dá)顯著增加，肝組織中磷酸化的NF-kB p65被激活，表明炎癥開始。同時，高脂喂養(yǎng)小鼠血清TNF-a、IL-6水平升高，肝臟mpo陽性細(xì)胞浸潤。所有劑量的CA補充均顯著扭轉(zhuǎn)了上述現(xiàn)象;在添加ca的ND組中沒有觀察到顯著差異(圖4A-G)。
圖4
5.補充CA可減少高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群失調(diào)
越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物群是NAFLD發(fā)展和進(jìn)展中的一種新的生物標(biāo)志物，它通過涉及炎癥反應(yīng)激活和代謝調(diào)節(jié)的機制促進(jìn)其發(fā)展。腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致NAFLD的可能機制可歸納為:干擾能量收獲和支出之間的平衡,促進(jìn)肝臟炎癥(損害腸道完整性、促進(jìn)內(nèi)毒素和啟動與細(xì)胞因子釋放炎癥級聯(lián)),并改變生物化學(xué)代謝和腸道m(xù)icrobiota-related代謝物(如膽汁酸,短鏈脂肪酸,芳香族氨基酸衍生品,支鏈氨基酸,等等)。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群組成及其代謝功能具有抑制NAFLD發(fā)展的潛力。此前的研究表明，多酚具有類似益生元的作用，能夠改變腸道微生物平衡，改善腸道黏膜炎癥和通透性。因此，我們分析了不同區(qū)域的腸道菌群組成研究結(jié)果表明，CA可能參與調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌組成。
研究了6組中回腸、盲腸、結(jié)腸3個腸段內(nèi)容物中腸道菌群組成的變化。如圖5A所示，與ND組相比，HFD小鼠回腸腸道菌群中觀察到的OTUs明顯降低，同時盲腸和結(jié)腸的OTUs也有下降趨勢。添加0.16% CA的HFD組小鼠回腸和結(jié)腸OTUs顯著增加。有趣的是，在添加0.08% CA的ND組中，除了結(jié)腸OTUs的減少外，添加CA可導(dǎo)致正常飼糧小鼠OTUs的減少。進(jìn)行Alpha多樣性分析，包括ACE(圖5B)、Chao1(圖5C)、Shannon(圖5D)和Simpson指數(shù)(圖5E)。ACE、Chao1、Shannon和Simpson的變化與OTUs的變化平行，表明HFD破壞了腸道菌群的豐富度和多樣性。同時，添加CA可在一定程度上恢復(fù)植物區(qū)系的豐富度和多樣性，尤其是在HFD中添加0.16% CA時。在ND組中添加CA導(dǎo)致了微生物群落豐富度和多樣性的降低，表明其作用可能與HFD組不同。此外，已知多酚可以下調(diào)微生物多樣性，顯著抑制致病菌的生長;因此，添加CA的ND組細(xì)菌OTU、豐富度和多樣性的降低可能與CA的抑菌作用有關(guān)。利用Beta多樣性分析分析腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的變化。主成分分析顯示不同的微生物群組成和單獨的集群之間HFD老鼠和ND老鼠,和HFD老鼠和HFD之間補充高濃度的CA。然而,HFD小鼠的腸道微生物群補充CA濃度較低的不是明顯不同于回腸HFD老鼠,盲腸和結(jié)腸。此外，ND處理組間的微生物菌群組成沒有差異(圖5F、G和H)。PCA識別出回腸、盲腸和結(jié)腸中兩個最易變的菌群——Allobaculum和Faecalibaculum，這意味著它們導(dǎo)致了組間觀察到的差異。PCA結(jié)果顯示，PC1(48.59%)具有a盲腸總方差高于PC2(21.36%)，說明CA處理可使hfd誘導(dǎo)的腸道菌群組成與ND組相似。通過beta多樣性分析，我們發(fā)現(xiàn)CA處理組(特別是添加0.16% CA)和HFD處理組具有不同的菌群組成，提示CA對腸道菌群的修飾作用。
圖5
6.腸道菌群與NAFLD相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性
CA對hfd誘導(dǎo)小鼠腸道菌群組成、體增重、內(nèi)臟肥胖、血脂水平、炎癥等有保護(hù)作用。我們進(jìn)一步采用Spearman秩相關(guān)法對上述過濾后的糞便細(xì)菌與NAFLD相關(guān)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。我們觀察到肝臟重量、體重、肝臟/體重、血清TC、HDL-C、LDL-C、LPS、TNF-a和IL- 6水平與Allobacul^n、Barne- siella、Faecalibacterium和uncultured_bact:erium_f_Muribaculaceae的相對豐度(屬水平)呈顯著負(fù)相關(guān)。此外,相對豐度(在屬級)的彎曲桿菌,Faecalibaculum,梭菌屬,Lachnospiraceae_XPB1014_group和uncultured_bacterium__p – 251 o5呈正相關(guān),與上面的非酒精性脂肪肝相關(guān)參數(shù),其中彎曲桿菌,Lach nospiraceae_XPB1014_group和uncultured_bacterium__p – 251 o5顯示最重要的正相關(guān)與非酒精性脂肪肝相關(guān)參數(shù)(圖6)。與這一結(jié)果一致,Allobaculum, Barnesiella,與ND組相比，高脂喂養(yǎng)小鼠的糞桿菌和未培養(yǎng)的細(xì)菌^Muribaculaceae減少。同時，HFD組Campylobacter、Faecalibaculum、Fusobacterium、Lachno- spiraceae_XPB1014_group和uncultured_bact:erium_f_p-251-o5的相對豐度增加，CA處理顯著降低了上述腸道菌群的相對豐度。
圖6
以上結(jié)果表明，HFD組的脂多糖抑制屬明顯減少。同時，HFD組的脂多糖產(chǎn)生屬增加，ca處理HFD組的脂多糖產(chǎn)生屬減少。例如，Allobaculum, Barnesiella和Faecalibacterium被報道為短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌。短鏈脂肪酸可能刺激上皮細(xì)胞增殖，并在改善腸道屏障完整性方面發(fā)揮重要作用，可能抑制LPS釋放和抗肥胖活性。彎曲桿菌是一種影響宿主健康的機會致病菌。大腸桿菌志賀氏菌(escherichia -志賀氏菌)是一種革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁中含有LPS，在HFD組中顯著增加。眾所周知，當(dāng)腸道屏障受損時，革蘭氏陰性菌釋放LPS到血液中，它們與小腸細(xì)菌過度生長密切相關(guān)。糞鈣桿菌(Faecalibaculum)和梭桿菌(Fusobacterium)均為促炎菌，可能破壞腸道屏障，并與惡化的肝臟脂肪變性有關(guān)。它們也可能有助于NAFLD患者血清LPS和TNF-a的高表達(dá)。因此，我們得出結(jié)論，CA有助于平衡腸道脂多糖相關(guān)菌群失調(diào)，并有助于預(yù)防NAFLD中低級別慢性炎癥。
在這項研究中,我們表明,補充低和高濃度的CA HFD不僅減少HFD-induced肥胖、改善血清脂質(zhì),ALT, AST,葡萄糖,hsCRP,有限合伙人,TNF-a和il – 6和鈍化脂肪生成,而且還改變了在非酒精性脂肪肝小鼠腸道微生物群組成,表明CA除了可以作為新策略來抑制非酒精性脂肪肝的發(fā)展。在大多數(shù)情況下，HFD中添加0.16% CA比低濃度CA更能有效地降低NAFLD相關(guān)參數(shù)。這些結(jié)果提示，腸道微生物群可能參與了CA對脂質(zhì)代謝和NAFLD的影響。
7.結(jié)論
本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠NAFLD模型，首次證實了CA對NAFLD小鼠腸道菌群的影響。我們報道CA顯著改變了腸道微生物的群落組成結(jié)構(gòu)，并降低了NAFLD參數(shù)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)一些微生物群的相對豐度與NAFLD參數(shù)密切相關(guān)。我們的研究結(jié)果表明，CA通過抑制腸道失調(diào)、促炎癥LPS釋放和隨后的脂質(zhì)合成等綜合反應(yīng)，對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD發(fā)展發(fā)揮保護(hù)作用。
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