發(fā)表期刊：Neuron
影響因子：17.173
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.12.010
發(fā)表日期：2021-01-06
摘要
單細胞測序技術，包括轉錄組和表觀基因組分析，正在改變我們對神經(jīng)回路的細胞構建模塊的理解。單細胞測序方法可以通過直接測序數(shù)千到數(shù)百萬單個細胞中的多個分子信號，全面表征腦細胞類型的多樣性。這些測序結果可以揭示特征細胞的基因調控機制，并提供腦細胞種群之間發(fā)育和進化關系。單細胞測序數(shù)據(jù)可以幫助設計用于腦電路組件的目標功能研究的工具，將分子特征與解剖學、連通性、形態(tài)學和生理學聯(lián)系起來。在此，作者討論了單細胞轉錄組和表觀基因在神經(jīng)科學中的關鍵應用。
前言
腦細胞是復雜的生物機器，其功能是由保守的基因表達程序在分子水平上定義的。要了解神經(jīng)細胞類型的分子特征，需要測序數(shù)千個基因，以發(fā)現(xiàn)細胞之間的細微差別。與此同時，需要大量的細胞樣本來捕獲罕見類型并準確評估他們之間的差異。對大量基因的細粒度分析和對大量細胞的覆蓋率的廣度分析常常被視為相互排斥的目標：通常情況下，實驗往往是在有限的樣本中檢測盡可能多的分子特征，或在大量樣本中瞄準少量基因。在本文中，作者對高通量單細胞測序分析是如何實現(xiàn)高分辨率、寬范圍的腦細胞類型分析進行總結和闡述。
DNA和RNA測序量化信息承載分子編碼并且制定每個細胞的生物學特性。RNA分子的豐度屬于轉錄組研究，而DNA和組蛋白的化學修飾以及細胞核內DNA的物理構象則屬于表觀基因組范疇(圖1A)。
圖1：神經(jīng)科學中的單細胞測序方法
成千上萬的基因和成千上萬的基因調控序列之間的相互作用，在每個細胞中產(chǎn)生了數(shù)百種的細胞表型。神經(jīng)科學家致力于利用細粒度、大范圍的單細胞測序數(shù)據(jù)來促進對腦細胞類型的轉錄組和表觀基因組特征的研究。
單細胞測序樣品的細胞信息攜帶分子
目前，對腦組織中RNA和DNA的分析在很大程度上還局限于對組織平均成分的批量分析。批量分析破壞了轉錄本或DNA修飾與單個細胞的聯(lián)系，可能無法檢測到罕見的細胞類型。一種細胞類型的基因表達特征可能被其他細胞類型的互補模式所掩蓋。盡管從特定細胞群純化整個細胞或細胞核的技術可以部分克服這些限制，然而，這需要高度選擇性的RNA或蛋白質標記或遺傳工具(如小鼠CRE系)，并且只能應用于先前已確定的細胞類型。
單細胞測序技術對來自單個細胞的RNA或DNA進行測序，不需要選擇性的細胞純化。這些技術可以概括為三個特征:范圍(細胞數(shù)量)、粒度(基因或表觀遺傳特征的數(shù)量)和空間分辨率(圖1B)。此外，單細胞技術可以檢測不同類型的RNA轉錄本或表觀遺傳修飾。雖然單細胞測序不需要細胞純化，但它依賴于高質量的原組織或冷凍組織。
哺乳動物細胞的轉錄組由10^5-10^6個單獨的信使RNA (mRNA)分子組成。這些信息代表每個細胞約4000 ~ 12000個不同的基因，包括許多編碼基因的多個變異的不同的mRNA亞型。盡管轉錄后調控是復雜的，但細胞中mRNA轉錄本的數(shù)量與編碼蛋白的豐度相關，因此是細胞身份和功能的標志。
單細胞表觀基因組分析方法還可以用于檢測DNA甲基化、染色質可及性和染色質構象等。這些DNA的化學和物理修飾是在發(fā)育過程中建立起來的，并在整個生命周期中調節(jié)基因的表達。而轉錄組信息表現(xiàn)了基因表達的差異，部分反映了細胞的狀態(tài)和組織收集前后神經(jīng)活動的影響，表觀遺傳標記(包括長壽命染色質成分的短暫和穩(wěn)定的修飾)。表觀基因組數(shù)據(jù)還可以解析順式調控元件的功能，如增強子可以建立和維持細胞類型特異性的基因表達。
綜上所述，單細胞轉錄組和表觀基因組測序共同構成了解析大腦細胞成分的強大工具，使研究健康和疾病大腦中特定細胞類型的功能成為可能。
單細胞轉錄組學
單細胞mRNA測序技術(scRNA-seq)使得腦細胞類型分子研究進入了的新時代。與常規(guī)的RNA測序(RNA-seq)一樣，scRNA-seq以mRNA分子為模板進行逆轉錄合成互補DNA (cDNA)。二代測序(NGS)文庫是通過cDNA擴增、片段化、附加擴增和NGS定量等步驟生成的。
多孔板法和液滴法
單個細胞或細胞核可以通過基于多孔板的細胞分選或液滴分選進行物理分離?；诙嗫装宓姆诌x方法使用熒光激活細胞分選(FACS) 或顯微鏡引導的毛細管將單個細胞或一組細胞分布到不同孔中?；谝旱蔚姆椒▽⒓毎蛛x到脂質懸浮的單個水室中。細胞在液滴中被裂解，mRNA分子被逆轉錄，并用能識別細胞的寡核苷酸條形碼標記。基于液滴的scRNA-seq是高效的，因為它的反應體積小，通過微流體裝置的連續(xù)流動可以快速處理數(shù)千個細胞。
通過物理方式分離細胞的另一種方法是使用細胞特異性條形碼組合的cDNA多路測序。一組細胞被分配到孔中（池化），用特定于孔的條形碼標記，然后合并，重新分配到不同的孔中，并用另一種條形碼標記。經(jīng)過多次池化、分離和標記，細胞獲得隨機的條形碼組合。可以調整每個孔的單元數(shù)，以確保大多數(shù)單元具有獨特的條形碼組合，由于條形碼碰撞可能會發(fā)生一些重疊。然后將來自所有細胞的cDNA匯集在一起并進行測序，然后通過計算將數(shù)據(jù)解析出來?；诓煌瑮l形碼組合和液滴的方法具有更高的通量和更低的單位細胞成本，而基于平板的方法提供更敏感的基因檢測和更可定制。
重要的是，這些策略在量化mRNA豐度方面存在差異(圖2A)?；谝旱蔚膕cRNA-seq方法計數(shù)方法對mRNA分子的5’ 端或3’ 端進行計數(shù)，結合獨特的分子標識(UMIs)，以避免重復計數(shù)同一分子的PCR產(chǎn)物。這些數(shù)據(jù)并不能區(qū)分共享相同啟動子或轉錄終止位點的mRNA異構體。相比之下，基于多孔板的分選策略可以對全長轉錄本的片段進行測序，包括覆蓋所有表達外顯子和剪接連接的內部片段。這些方法表明mRNA異構體的使用在不同的腦細胞類型中是不同的。通過結合UMIs的全轉錄序列測序，可以在單細胞中重建數(shù)千個獨特的mRNA分子。
圖2：單細胞轉錄組學在神經(jīng)科學中的應用
單細胞和單細胞核
腦組織中樹突、軸突和膠質過程的復雜網(wǎng)絡對scRNA-seq提出了多重挑戰(zhàn)。遠端細胞中包含大量的能夠指導合成樹突狀蛋白的mRNA。然而，這些轉錄本在解剖和細胞分離后大部分丟失。因為所有轉錄本都起源于細胞核，scRNA-seq仍然可以在細胞核或體細胞中捕獲新合成的樹突和軸突mRNA，然后將其運輸?shù)竭h端細胞中。此外，scRNA-seq不能應用于冷凍的腦組織，因為在冷凍過程中細胞膜會破裂。
另一種方法是單細胞核測序。核轉錄本包含細胞中的20%-50% RNA，包括未成熟RNA以及未剪接RNA分子(圖2A)。盡管如此，與scRNA-seq相比，snRNA-seq提供了更好的腦細胞類型標記和分辨率。
與scRNA-seq相比，snRNA-seq數(shù)據(jù)可能較少受到某些技術限制的影響。由于細胞核的大小和形態(tài)相對一致，snRNA-seq比scRNAseq更有可能捕獲所有類型的細胞。此外，在組織剝離和細胞分離過程中，snRNA-seq不太容易受到虛假的基因表達激活的影響。
單細胞轉錄組學在神經(jīng)科學中的應用
細胞類型定義和表征
單細胞技術改變了我們對腦細胞種類多樣性的認識。幾十種形態(tài)和功能上截然不同的腦細胞類型已經(jīng)被確認，但是傳統(tǒng)的顯微鏡和生理學方法對哺乳動物大腦回路中數(shù)百萬個細胞的細胞類型進行全面表征的范圍有限。最近的scRNA-seq研究在小鼠大腦區(qū)域取樣可以達到20,000到 750,000個細胞。最大的單個scRNA-seq/snRNA-seq數(shù)據(jù)僅代表了成年小鼠大腦中近1億個神經(jīng)元和膠質細胞的1%(圖1B)。
人類大腦的神經(jīng)元細胞比小鼠大腦多1000倍，全面取樣更令人生畏。來自人類大腦多個區(qū)域的單核轉錄組已經(jīng)建立了細胞類型分類(圖2B-2D) 。將人類與小鼠和非人類靈長類動物進行比較，揭示了保守而獨特的細胞類型特征，包括細胞群體比例的物種特異性差異，以及同源細胞類別和類型內的基因表達的差異。scRNA-seq/snRNA-seq還提供了對膠質細胞多樣性的了解，包括少突膠質細胞譜系和小膠質細胞的功能狀態(tài)。
scRNA-seq也被應用于非哺乳動物的大腦，闡明了關于發(fā)育、細胞調控和衰老的基本問題。例如，衰老極大地減少了果蠅腦細胞中的RNA數(shù)量。在斑馬魚的大腦中，不同的神經(jīng)干細胞群體在阿爾茨海默病(AD)模型中受到淀粉樣蛋白毒性的影響不同。
發(fā)展和可塑性
scRNA-seq揭示了小鼠和人類大腦甚至在整個生物體發(fā)育中的神經(jīng)元和膠質細胞類型的發(fā)育。scRNA-seq/snRNA-seq是特別適合研究大腦發(fā)育的方式，因為關鍵的干細胞和神經(jīng)祖細胞群可能是短暫的，在沒有事先了解特定分子標記的情況下很難分離。scRNA-seq在多個時間點可以重建發(fā)育軌跡，揭示轉錄因子的動態(tài)和下游效應體調節(jié)特定的神經(jīng)群體。新生神經(jīng)元和成人少突膠質細胞的分化軌跡也可以重建。一個scRNA-seq/snRNA-seq的前沿領域是與人工標記的譜系追蹤結合或與一個譜系內細胞自然的體細胞突變相結合。
除了發(fā)育動力學外，神經(jīng)活動和可塑性導致的基因表達變化可以通過snRNA-seq/scRNA-seq評估，如視覺皮質神經(jīng)元在光照后的表現(xiàn)。此外，分析活性調節(jié)基因可以識別活性細胞。考慮到活性和鈣信號依賴的基因調控在突觸可塑性中的關鍵作用，體系的背景信號對于單細胞計數(shù)分辨細胞類型特異性的轉錄組動力學至關重要。
細胞類型在疾病中的作用
通過應用于患者死后腦組織的snRNAseq，可以研究疾病的轉錄組特征。通過對48例AD患者的80000個單核細胞進行snRNA-seq檢測，在單個細胞類型中檢測到的差異表達(DE)基因比在組織中檢測到的多。特別是，神經(jīng)膠質細胞的基因失調在snRNA-seq中檢測到，但在大量的RNA-seq中沒有檢測到，因為神經(jīng)膠質對組織中總RNA的貢獻相對較低。snRNA-seq已經(jīng)應用于AD、重度抑郁癥、自閉癥、雷特綜合征和多發(fā)性硬化癥等疾病患者的腦組織。
值得注意的是，疾病研究集中在相對少量的轉錄組或表觀基因組簇對應于細胞類別，而不是單個類型。解剖細粒細胞類型對疾病的貢獻是重要的，但具有挑戰(zhàn)性，因為在計算分配單個細胞集群的偏差可能會顯著影響研究結果。
圖3：單細胞表觀基因組學
單細胞表觀基因組學
基因的穩(wěn)定表達部分是通過DNA的表觀遺傳修飾來維持的，如基因組胞嘧啶甲基化和組蛋白的甲基化修飾。這些標記通過引導轉錄因子蛋白與特定基因組區(qū)域的結合來影響基因表達，從而增強或降低附近或遠端基因的轉錄。盡管單個mRNA分子半衰期為幾分鐘到幾小時，但有絲分裂后的神經(jīng)元中DNA和某些組蛋白的共價修飾可以持續(xù)數(shù)月到數(shù)年。表觀基因組的動態(tài)調節(jié)跨越腦細胞類型和整個生命周期，建立和維持細胞身份，并且可能影響染色質可塑性和行為。單細胞表觀基因組可以補充轉錄組，提供細胞類型特異性基因表達調控的方式。
與snRNA-seq一樣，表觀基因組分析可以應用于從冷凍和儲存的死后組織中獲得游離的細胞核。這些方法可以評估包括超過95%基因組的非蛋白質編碼區(qū)域。非編碼區(qū)包含數(shù)百萬個影響基因表達的候選順勢作用元件(cCREs)，包括啟動子和增強子。cCREs的定義是染色質開放區(qū)，DNA甲基化水平低，并且可以通過細胞核內DNA的三級結構與基因的啟動子物理相互作用。識別細胞類型特異性的增強子可以指導針對功能研究細胞類型的病毒載體和轉基因株系的開發(fā)。未來，我們將在單細胞水平上研究表觀基因組的動態(tài)調控，包括發(fā)育軌跡和學習和記憶過程中神經(jīng)元活動依賴的基因組修飾。
DNA甲基化
在哺乳動物中，基因組胞嘧啶可以被一個甲基基團共價修飾。甲基胞嘧啶(mC)經(jīng)常在CG雙核苷中被發(fā)現(xiàn)，它經(jīng)常與轉錄抑制相關。與其他細胞相比，腦細胞中的DNA甲基化有兩個獨特的特點。首先，神經(jīng)元具有高水平的羥甲基胞嘧啶(hmC)，這是mC的衍生物，可能具有不同的功能。其次，在發(fā)育過程中，神經(jīng)元在非CG位點積累大量mC，(主要是CA和CT二核苷酸)。在整個基因組中，近10億個CG和非CG位點的DNA 甲基化修飾(mC)和羥甲基化修飾(hmC)是神經(jīng)元和膠質細胞中細胞類型特異性基因調控的特征。
DNA甲基化可以使用基于多孔板的單個核分選，然后進行DNA的亞硫酸氫鹽轉化和測序，每個細胞可以捕獲高達30%的基因組。亞硫酸氫鈉處理可以將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶無法被轉化，因此在DNA亞硫酸氫鹽轉化后進行測序可以揭示甲基化狀態(tài)胞嘧啶位置。該技術從45個小鼠大腦區(qū)域獲得了超過110,000個單細胞DNA甲基化信息，在大腦皮層、紋狀體和嗅覺區(qū)域識別了161個準確的神經(jīng)元細胞類型。每個神經(jīng)元群體在基因體上都有獨特的DNA甲基化特征，并且這些特征與基因表達密切相關(圖3B)?；谝旱蔚膩喠蛩釟潲}化學可以潛在地提高單細胞DNA甲基組分析的效率，但與轉錄組測序相比，全基因組測序的高成本仍將是限制該技術在大量細胞中應用的一個因素。未來，單細胞的羥甲基化分析將闡明神經(jīng)元細胞類型中mC和hmC的相對數(shù)量。
一維染色質可及性圖譜
正如基因是轉錄組分析的基本單位一樣，cCREs是表觀基因組分析的基礎。cCREs可以通過與轉錄因子蛋白結合導致核小體移位，形成可及性染色質區(qū)域。snATAC-seq可以利用Tn5轉座酶捕獲并繪制這些區(qū)域的圖譜。
與scRNA-seq/snRNA-seq一樣，snATAC-seq也可以使用液滴及index組合進行分析。snATAC-seq可應用于冷凍腦組織，每次實驗可以捕獲大于10^4個細胞。值得注意的是，在所有可以在特定細胞類型中檢測到的遠端cCREs中，snATAC-seq捕獲大約每個細胞的2%-3%。這種較低的覆蓋率可以反映該試驗的敏感性，和在同一類型的單個細胞間的異質性可及性。
盡管覆蓋率較低，snATAC-seq數(shù)據(jù)可靠地準確區(qū)分了神經(jīng)元和膠質細胞類型。例如，我們使用snATAC確定了160種細胞類型。在所有類型的細胞中，總共發(fā)現(xiàn)了50萬個可達區(qū)域(cCREs)。另外，在用Tn5轉座酶批量標記開放的染色質后，液滴可用于物理分離細胞核并進行標記，每個細胞產(chǎn)生多達34,000個獨特的測序片段。雖然scRNA-seq/snRNA-seq數(shù)據(jù)需要使用先前注釋過的基因和轉錄本進行量化的，但可獲得的染色質區(qū)域在整個基因組中分布，通常無法提前推斷。許多類型的特征已被用于量化snATAC數(shù)據(jù)，包括基因啟動子、假定的增強子以及共同DNA序列基序的區(qū)域組合等。每一種方法對不同的生物信號都很敏感，并受到片段采樣所引入的背景信號的不同影響。計算分析方法的系統(tǒng)基準和比較對于實現(xiàn)最大可能的分辨率很重要。
染色質的三維構象
CREs和基因啟動子通過染色質環(huán)和三維結構域相互作用(圖3D)。染色質三維構象的單細胞分析與在大量組織中使用的高通量基因組捕獲技術(Hi-C)密切相關，通過交叉連接、碎片化和在位置上接近的DNA片段重組，識別相互作用的區(qū)域。對得到的文庫進行測序可以檢測到嵌合DNA片段，這些片段包含一維基因組中相隔很長一段距離，但它們在三維空間中緊密相連的序列。這些關聯(lián)的信息可以用接觸矩陣表示(圖3C)。
染色質三維構象分析的一個挑戰(zhàn)是染色體位置之間有很大的空間可以發(fā)生可能的成對接觸。即使在單細胞Hi-C實驗中可以捕獲基因組的很大一部分，產(chǎn)生的成對接觸矩陣也只包含基因組位置三維之間接觸的一小部分，因為每個DNA片段只能反應一次連接事件。單細胞Hi-C數(shù)據(jù)的聚類分析可以識別具有相似染色質組織的細胞組，但其本身并不能可靠地區(qū)分皮質神經(jīng)元類型。一種替代策略是使用薄的(- 0.2mm)組織切片，然后用激光捕獲單個核和同一切片中的測序片段。
單細胞表觀基因組學的應用
解剖神經(jīng)元基因調控網(wǎng)絡
單細胞表觀基因組可以用來描述有關建立和維持腦細胞類型識別的轉錄因子和cCREs之間的調控網(wǎng)絡。與DNA結合的蛋白通常識別6-10個堿基對的特定序列或基序(圖3A，Luo 等，2017)。通過檢測cCREs中富集的序列，并與已知的轉錄因子結合基序進行比較，可以識別調節(jié)特定腦細胞類型的轉錄因子。該方法應用于整合小鼠運動皮層的多模態(tài)(轉錄組和表觀基因組)數(shù)據(jù)，揭示了轉錄因子Rfx3在調節(jié)興奮神經(jīng)元中的作用。通過檢測結合位點的染色質可及性特征，可以對轉錄因子結合的確切位置進行高精度分析。然而，到目前為止，這種分析僅限于大量樣本的染色質可塑性分析。
遺傳因素與疾病風險的聯(lián)系
盡管全基因組關聯(lián)研究(GWASs)已經(jīng)確定了一些神經(jīng)和精神疾病的風險位點，但每種疾病中特定腦細胞類型的脆弱性在很大程度上仍是未知的。通過細胞類型特異性轉錄組或表觀基因組的遺傳分析可以識別活躍基因在GWAS風險位點附近富集的細胞類型，表明其在疾病中可能具有直接或間接的作用(圖3F)。
局限和展望
單細胞測序正在改變生物學的許多領域，其影響可能在神經(jīng)科學方面尤其深刻。腦細胞類型的多樣性，以及在整個神經(jīng)元生命周期中細胞身份和依賴經(jīng)驗的可塑性的復雜調節(jié)，使得單細胞分析對于理解大腦回路至關重要。
像其他任何新興技術一樣，單細胞測序也有重要的局限性。在單孔或液滴中捕獲兩個或多個細胞，或用相同的條形碼標記，可能會使單細胞數(shù)據(jù)不準確，并產(chǎn)生虛假的混合細胞類型。RNA-seq文庫的污染會導致假陽性結果。更大的局限性在于假陰性或丟失，因為采樣策略通常只恢復總RNA或DNA的一小部分。單細胞技術也會受到組織剝離和細胞分裂引起的非生理轉錄的影響。
單細胞技術的一個更基本的限制是需要破壞細胞以提取其分子特征以進行測序。雖然多組學和多模態(tài)技術可以增加每個細胞獲得的信息，但這些方法本質上是細胞生命周期的快速捕捉，并沒有記錄對大腦功能至關重要的神經(jīng)調節(jié)的動態(tài)變化。通過分析成熟和不成熟的RNA轉錄本，可以推斷出一些動態(tài)信息，但在單細胞中真正測量轉錄組動力學將在大腦相關的研究中有重要價值。
單細胞數(shù)據(jù)集的復雜性既是機遇也是挑戰(zhàn)。用于聚類、可視化和分析單細胞數(shù)據(jù)的復雜計算方法為深入了解細胞的功能提供了豐富的見解。然而，對于相同的數(shù)據(jù)，不同的計算方法或參數(shù)選擇可能導致不同的結果。聚類程序因其不一致性和缺乏穩(wěn)定性而導致在描述單細胞數(shù)據(jù)的細胞類型方面的主觀性。單細胞研究必須通過公開透明地調查和生物學結論報告如何依賴于分析選擇，并公布代碼和數(shù)據(jù)來重現(xiàn)所有分析解決這一問題。
最大的挑戰(zhàn)是將來自單細胞測序的信息與神經(jīng)元細胞類型識別的功能和生理指標統(tǒng)一起來。盡管在轉錄組學、表觀基因組學、解剖學和形態(tài)學標準定義的細胞類型之間存在顯著的對應關系，但在數(shù)百種精細腦細胞類型水平上協(xié)調這些數(shù)據(jù)仍處于早期階段。
隨著單細胞技術的創(chuàng)新克服了這些挑戰(zhàn)，它們正在為神經(jīng)科學研究開辟新的前沿領域。單細胞測序提供了對多個物種和不同發(fā)育階段大腦細胞成分的全面、全腦分析。將單細胞測序與電生理學、形態(tài)學和連通性聯(lián)系起來的技術將深刻地改變我們對神經(jīng)元多樣性維度的理解?？缥锓N和發(fā)育階段的腦細胞類型的比較將改變我們對大腦發(fā)生和系統(tǒng)發(fā)育的理解，并可能影響對神經(jīng)群體間進化關系的詳細機制理解。進化保守性和分化提供了對基因調控程序的深入了解，這些基因調控程序對因為它們認知功能的影響而被選擇。通過結合單細胞測序和活性依賴標記技術，神經(jīng)科學家將能夠將轉錄組和表觀基因組與特定細胞類型在行為中的作用聯(lián)系起來。除了技術進步，我們期望新的概念和理論的出現(xiàn)，從而將從單細胞測序的巨大信息轉化為關于腦細胞個體發(fā)生和功能的有組織和系統(tǒng)的知識。
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