甘薯鐮刀菌根莖腐爛病病原菌基因組序列發(fā)布！

近日， Microbiology Spectrum（IF 9.0431）在線發(fā)表了廣東省農(nóng)科院作物所黃立飛副研究員、房伯平研究員為通訊作者的研究論文 “Whole-Genome Sequencing and Comparative Genome Analysis of?Fusarium solani-melongenae?Causing Fusarium Root and Stem Rot in Sweetpotatoes”，該研究報道了F. solani-melongenae?分離株 CRI 24-3 的全基因組組裝序列，并且深入探討其功能基因信息，為其他密切相關的鐮刀菌屬物種的基因組研究提供基礎，通過比較基因組分析促進了對鐮刀菌基因組特征和進化關系的整體理解。百邁客有幸參與此項研究工作，對該真菌全基因組進行測序組裝注釋和比較基因組分析。

摘要

甘薯（Ipomoea batatas）是全球第八大重要作物，然而，甘薯的生產(chǎn)和質(zhì)量受到世界各地流行的鐮刀菌病害的威脅。在這項研究中，研究了一種導致甘薯根和莖腐爛的鐮刀菌。使用二代和三代高通量測序技術分離和測序病原真菌 CRI 24-3，獲得包含 15,374 個預測編碼基因的 49.6 Mb 基因組。分子系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CRI 24-3 是?F. solani-melongenae?菌株，位于?F. solani?物種復合體 (FSSC) 的進化枝 3 內(nèi)。與其他測序 FSSC 中鑒定的毒力因子數(shù)量相比，CRI 24-3 顯示出相對較高數(shù)量的毒力因子，例如碳水化合物活性酶 (CAZymes)、病原體-宿主相互作用 (PHI) 蛋白和萜烯合酶 (TSs)成員。比較基因組分析揭示了 CRI 24-3 與其他 FSSC 物種之間相當大的保守性和獨特性?？傊?，本研究的結果提供了有關甘薯鐮刀菌的重要遺傳信息，有助于探索致病機制和制定鐮刀菌病管理策略。

結? 果

真菌分離和形態(tài)學分析表明CRI 24-3是FRST的病原菌

田間分析表明，水浸病斑最初出現(xiàn)在FRST感染甘薯的基部莖上（圖1A）。此外，在潮濕或多雨的天氣中，觀察到大量的紅色外皮覆蓋在壞死的基部莖上（圖1B）。隨著病害蔓延，上部莖葉逐漸褪綠和枯萎。貯藏根呈凹形病斑，環(huán)狀邊緣清晰，白色菌絲分布在凹陷病斑上，塊莖內(nèi)部有破裂的壞死組織（圖1C和D），從而顯著降低甘薯的產(chǎn)量和質(zhì)量。從患病甘薯樣品中分離出優(yōu)勢真菌菌落 CRI 24-3。然后根據(jù) Koch 的假設進行 CRI 24-3 的致病性測試。切片的根部觀察到超過接種點的水褐色病斑，菌絲稀疏，陰性對照不存在（圖1C），表明CRI 24-3是甘薯FRST的致病因子。

CRI 24-3 在馬鈴薯蔗糖瓊脂 (PSA) 和合成低營養(yǎng)瓊脂 (SNA) 上培養(yǎng)，用于進一步的形態(tài)學分析。在培養(yǎng)箱（25°C、12 小時光周期和 75% 相對濕度）中培養(yǎng) 4 天后，PDA 上的平均菌落直徑為 4.4 cm。蓬松的菌落有分隔的氣生菌絲體，散布在盤子上。菌落表面呈乳白色，背面呈黃色（圖2A至C）。小分生孢子豐富，呈橢圓形至腎形，大多數(shù)為 1 隔（圖 2E）。1 隔小分生孢子為 (7.8 至 13.8) × (2.1 至 3.9) μm。大分生孢子呈鐮刀形，3-5 縱隔，頂端細胞稍彎曲，基底細胞呈足狀（圖2F）。3 至 5 隔大分生孢子的平均寬度為 4.1 至 4.9 μm。來自短側枝的末端或閏厚厚孢子（6.1至7.4μm）是球形和粗糙的（圖2H）。4周后，菌落被點狀暗紅色外皮覆蓋，類似于田間受感染的甘薯（圖1B和2I）。CRI 24-3 的梨形外皮層具有乳頭狀頸部和小孔（圖 2J），子囊孢子通過小孔釋放。此外，棒狀子囊含有 8 個單列 1 隔子囊孢子，大小為（10.7 至 12.6）×（3.9 至 5.0）μm（圖 2K和L）。相比之下，SNA 上的菌落生長較弱（圖 S1），底物菌絲稀疏，4 天后平均直徑為 4.1 厘米。SNA上CRI 24-3分生孢子和周殼的數(shù)量相對于PSA上的較少。然而，分生孢子和外皮的形態(tài)特征與在 PDA 上觀察到的相似。分離株CRI 24-3（登錄號ACCC 39784）的代表性培養(yǎng)物保藏在中國農(nóng)業(yè)培養(yǎng)物保藏中心。

生成并注釋了 CRI 24-3 的高質(zhì)量基因組組裝草圖

經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控后共獲得 452,011 條高質(zhì)量的clean reads（平均長度 13,525.1 bp）（表 S1）。CRI 24-3的 49.6 Mb 基因組是由 12 個contigs產(chǎn)生的，該基因組具有 4.5 Mb 的contigs N50 和 50.7% 的 GC 含量，覆蓋深度估計為 123.3 倍（圖 3；表 1）?；蚪M質(zhì)量評估結果表明，CRI 24-3 的基因組組裝完整且準確，因為 CRI 24-3 中的單拷貝直系同源基因與 sordariomycetes_odb10 數(shù)據(jù)集中所有 3,817 個完整核心基因的 99.9% 匹配（表 1）。

使用三種基因結構預測方法，共鑒定了 15,374 個平均基因長度為 2.0 kb 的預測基因（圖 S2A；表 1）。此外，基于序列相似性比較，通過多個功能數(shù)據(jù)庫注釋了 15,256 個蛋白質(zhì)編碼基因（表 2）?；诜侨哂嗟鞍踪|(zhì)序列 (Nr) 數(shù)據(jù)庫分析（圖 S2B），CRI 24-3 中約 80.3% 的蛋白質(zhì)編碼基因與F. vanettenii?77-13-4 的基因組匹配，這表明這兩個物種密切相關。此外，對 10,655 個蛋白質(zhì)編碼基因進行了基因本體論 (GO) 分析（表 2) 并在功能上分為三類：“細胞成分”(7,100)、“分子功能”(8,279) 和“生物過程”(8,069)。使用真核直系同源群 (KOG) 數(shù)據(jù)庫進行的進一步功能分析表明，“僅一般功能預測”類別 (R, 22.2%) 的蛋白質(zhì)數(shù)量多，其次是“次級代謝物生物合成、轉運和分解代謝”類別（Q，8.4%）和“能源生產(chǎn)和轉換”類別（C，7.8%）（圖 3）。此外，使用京都基因和基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫對 3,925 個編碼基因的分析表明，2,329 個基因富集在屬于五個類別的 114 個代謝途徑中（圖 S4；表 2）。大多數(shù)基因富含碳水化合物（471）和氨基酸代謝（435）途徑。

基于分子系統(tǒng)發(fā)育分析，CRI 24-3 被鑒定為F. solani-melongenae

使用 BLASTn 工具與 NCBI 數(shù)據(jù)庫的比對表明，從 CRI 24-3 基因組 DNA 擴增的 ITS 序列 PCR 與F. solani-melongenae?NRRL 22101 具有 99.8% 的同一性，具有 100% 的查詢覆蓋率（未發(fā)表的數(shù)據(jù)），表明 CRI 24-3 是 FSSC 的成員。為了更準確地識別 CRI 24-3，進行了基于ITS、RPB2和TEF 1-α的串聯(lián)序列的信息系統(tǒng)發(fā)育分析（圖 4A）。組合序列樹中的大多數(shù)引導值高于 ITS 樹（未發(fā)布數(shù)據(jù)）中的值。三基因座樹顯示了一個優(yōu)勢分支，包括 FSSC 進化枝 3 內(nèi)的 38 個群內(nèi)末端，F(xiàn)SSC 進化枝 1 和 2 內(nèi)的分類群形成了一個基礎姊妹群（圖 4A和表 S2）。由 FSSC 分類群形成的主要分支被分成一個末端節(jié)點，包括 CRI 24-3 和另一個包含F. protoensiforme?(FSSC 32) 和F. riograndense的亞基底節(jié)點。重要的是，CRI 24-3 與F. solani-melongenae密切相關，并聚集在 FSSC 進化枝 3 中。因此，F(xiàn)RST 的分離株 CRI 24-3 被鑒定為F. solani-melongenae?(FSSC 21) ，此方法是基于 Nilsson 等人提出的方法。

探索了 CRI 24-3 和 15 個基因組測序的 FSSC 物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系（表 S3）。F. illudens?NRRL 22090 被用作外群以生成有根的系統(tǒng)發(fā)育樹。來自 16 個鐮刀菌基因組共享的 1,544 個單拷貝同源基因的全基因組系統(tǒng)譜得到了很好的支持，其中 14 個節(jié)點具有 100% 的引導值（圖 4B）。16 個 FSSC 物種分為三個已知的進化枝。系統(tǒng)基因組關系分析顯示 CRI 24-3 與F. falciforme?(FSSC 3 + 4)密切相關，具有 100% 引導支持。這兩個物種與F. vanettenii、F. solani和F. metavorans形成了一個單系群。，表明這些物種可能共享一個祖先。

在 CRI 24-3 中發(fā)現(xiàn)了豐富的毒力因子，包括獨特的單孢二烯合酶

在這項研究中，在 CRI 24-3 中鑒定了 889 個推定的 CAZymes 編碼基因（表 S4），這可能與前面描述的突出的碳水化合物代謝途徑有關（圖 3；圖 S4）。CRI 24-3 中 CAZymes 的數(shù)量相對于其他一些鐮刀菌更高（例如， FSSC 進化枝 2 內(nèi)的F. virguliforme中的 629 個；FSSC 進化枝 3 內(nèi)的F. neocosmosporiellum?中的551個；在來自?F. sambucinum?物種復合體的禾谷鐮刀菌中的481個）。CAZymes 根據(jù)它們的家族分布和基因數(shù)不同（圖 5A ）分為六類，糖苷水解酶 (GHs, 379) 是大的一類，其次是碳水化合物酯酶 (CEs, 199) 和輔助活性 (AAs, 136)。CRI 24-3 有 60 個 GH 家族，其中大多數(shù)酶分布在 GH3 (37)、GH43 (35)、GH109 (35) 中，而一些常見的 GH 亞家族，如 GH29、GH30 和 GH44，在 CRI 24-3中不存在(圖 5B )，類似于F. virguliforme?中的 CAZyme 曲線。在 CRI 24-3 中鑒定了來自 GH11 的三種假設的 β-1,4-木聚糖酶，稱為 FsmGH11.1、FsmGH11.2 和 FsmGH11.3（表 S4）。多重比對（圖S5）顯示FsmGH11.3與NhGH11（GenBank登錄號XP_003050975.1 ）具有高的序列相似性（44.1％），NhGH11是來自F. vanettenii?GH11的β-1,4-木聚糖酶被證明可以分解各種木聚糖底物，這暗示 FsmGH11.3 和 NhGH11 可能具有相似的木聚糖酶水解能力。

比較基因組分析揭示了 CRI 24-3 和其他 FSSC 物種的基因組保守性和獨特性

比較來自 18 個鐮刀菌屬物種的基因組，包括 16 個已測序的 FSSC 物種、F. fujikuroi和F. oxysporum，以進一步探索基因組多樣性和進化關系（表 3；表 S3）。通過基因家族結構分析，共鑒定和注釋了包含 279,680 個基因的 16,130 個家族（GF1 至 GF16,130）。結果表明，18個類群共有4300個基本科，其次是兩個類群的2990個科和786個物種特異性科（圖6A和B ））。大約 59.6% 的檢測到的基因屬于共享家族，其中 1,544 個家族具有單拷貝基因。值得注意的是，上一部分提到的效應子PKS（EVM0010851.1）聚集在一個共享家族（GF2338）中，在Pfam注釋中具有特征性的?；D移酶結構域。

其他三種密切相關的 FSSC 物種F. falciforme、F. solani和F. vanettenii的基因組被用作參考基因組來探索 CRI 24-3 的選擇壓力。分別確定了 CRI 24-3 與?F. falciforme、F. solani?和F. vanettenii?之間的 2265、2272 和 2272 直系同源物對的非同義替換率 (Ka) 與同義替換率 (Ks) 的比率（ 圖 6C 至 E)。Ka /Ks總體分析的值小于 1，表明 CRI 24-3 中的大多數(shù)直系同源物似乎都經(jīng)過了純化選擇并且高度保守。然而，CRI 24-3 和F. falciforme基因組的比較確定了一個快速進化基因對（EVM0014458.1 與 GE10416_g）的 Ka /Ks比率大于 1，表明陽性選擇可能發(fā)生在進化?；蚪M共線性分析表明，F. vanettenii和F. oxysporum基因組中的幾個染色體片段在 CRI 24-3 中濃縮成一個片段，并有一些倒位（圖 6F ）。此外，CRI 24-3 中的一些直系同源物具有多對一的關系。CRI 24-3 中至少有兩個查詢基因與參考物種中的相同直系同源物匹配。值得注意的是，CRI 24-3 的重要基因組區(qū)域不能與尖孢鐮刀菌基因組中的那些共線性耦合，由 35.9% 的共線性率（共線直系同源物對與所有直系同源物對的比率）支持，該比率低于CRI 24-3 和F. vanettenii?(77.6%)。結果表明，CRI 24-3在系統(tǒng)發(fā)育上與尖孢鐮刀菌相距較遠。MAT基因座對于在鐮刀菌屬中產(chǎn)生子囊孢子至關重要。在此，交配型結構組織 ( MAT ) 基因座在基于簡化的共線性分析比較了茄科鐮孢菌CRI 24-3、禾谷鐮刀菌PH-1 和F. vanettenii?77-13-4（圖 7）。與僅攜帶 MAT1-1 基因的?F. vanettenii?77-13-4相比， CRI 24-3 含有MAT1-1和MAT1-2獨特型基因，在單個MAT基因座處與禾谷鐮刀菌密切相關，除了 CRI 24-3 是 MAT1-2-3 缺陷型。只有位于 CRI 24-3 中 MAT1-2-1 上游區(qū)域的沒有任何特征功能域的片段與禾谷鐮刀菌中的 MAT1-2-3 具有序列相似性。

總? 結

本研究發(fā)現(xiàn)了一種新型鐮刀菌病害，可導致甘薯根和莖腐爛。致病因子F. solani-melongenae分離株 CRI 24-3 的基因組測序。該結果將指導其他密切相關的鐮刀菌基因組序列的組裝。對已測序的 FSSC 成員的基因組進行全面的基因組比較分析，可以提高對 FSSC 甚至整個屬的遺傳特征的理解。此外，進一步分析促進植物感染的毒力因素將為制定鐮刀菌病害管理策略提供基礎，從而大限度地減少經(jīng)濟損失。

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