2022年10月19日，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部姜長(zhǎng)濤團(tuán)隊(duì)聯(lián)合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院、復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院和溫州醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際期刊《Nature》雜志在線發(fā)表了題為“Gut bacteria alleviate smoking-related NASH by degrading gut nicotine”的重磅研究。該研究解析了腸道尼古丁積累在非酒精性脂肪性肝炎進(jìn)展中的作用，發(fā)現(xiàn)了人類腸道中一種能夠代謝尼古丁的內(nèi)源性細(xì)菌，并提出了一種可能的減少吸煙加劇NAFLD進(jìn)展的途徑。百邁客為該研究提供了宏基因組測(cè)序服務(wù)。
研究背景
吸煙是人類常見的不健康行為之一，世界衛(wèi)生組織將吸煙列為可預(yù)防死亡的主要原因。戒煙是延長(zhǎng)預(yù)期壽命的有效方法，但由于尼古丁的強(qiáng)大成癮性和戒斷癥狀，戒煙并不容易實(shí)現(xiàn)。尼古丁降解最近被認(rèn)為是阻斷尼古丁誘發(fā)的病理的一種策略。NAFLD（非酒精性脂肪肝病）包含廣泛的病理，通常從簡(jiǎn)單的脂肪變性發(fā)展為 NASH（非酒精性脂肪性肝炎），然后在某些情況下發(fā)展為肝硬化和肝癌。由于腸道產(chǎn)生的代謝物在通過(guò)腸-肝軸的 NAFLD 進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用，因此建立腸道尼古丁積累、腸源性代謝物和NAFLD進(jìn)展之間的關(guān)系可以為吸煙相關(guān)的肝臟疾病提供新的線索。
研究設(shè)計(jì)
三個(gè)隊(duì)列：
隊(duì)列1：30名非吸煙者和30名吸煙者采集血清和糞便樣本。
隊(duì)列2：從41名確診為NAFLD的吸煙者身上采集了血清和糞便樣本。
隊(duì)列3：42名經(jīng)活檢確診為NAFLD的非吸煙者的血清和糞便樣本。
研究結(jié)果
1.腸道細(xì)菌降解回腸中尼古丁
在吸煙或使用尼古丁貼劑期間，人體唾液和胃液中可檢測(cè)到高水平的尼古丁，表明其在消化道中積累，在消化道中可能產(chǎn)生病理性作用。為了確認(rèn)吸煙期間尼古丁是否在腸道中積聚，研究者收集了 30 名非吸煙者和 30 名吸煙者的回腸末端黏膜活檢、血清和糞便樣本。在吸煙者的回腸粘膜組織中檢測(cè)到高水平的尼古丁，表明在吸煙期間尼古丁會(huì)在腸道中積聚（圖 1a）。進(jìn)一步評(píng)估了通過(guò)三種先前描述的給藥方法（即煙霧暴露，口服和皮下）。在上述小鼠模型中始終觀察到回腸尼古丁積累（圖 1b、c 補(bǔ)充圖1a）。這些結(jié)果表明，吸煙期間的尼古丁水平在腸道中積累的程度相對(duì)較大，這可能具有病理生理學(xué)意義。
在尼古丁飲用水輸送模型中，無(wú)菌(GF)小鼠的回腸內(nèi)容物和回腸組織中的尼古丁濃度都高于SPF小鼠，這表明內(nèi)源性腸道細(xì)菌有助于尼古丁的降解(圖1C)。為了確定特定的人類內(nèi)源性尼古丁降解腸道菌群，研究者從公共宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選攜帶已知尼古丁分解代謝基因的潛在菌株。在幾個(gè)菌株中發(fā)現(xiàn)了nicA（一種已知的尼古丁降解酶）的同源序列，表明這些菌株具有降解尼古丁的潛力(補(bǔ)充圖1B)。對(duì)30名吸煙者的糞便樣本進(jìn)行了宏基因組學(xué)分析，以確定與回腸尼古丁濃度降低最相關(guān)的物種。根據(jù)回腸尼古丁水平，參與者被定義為低尼古丁(LN)或高尼古丁(HN)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1C)。值得注意的是，LN組和HN組之間在吸煙史(包括吸煙年限和每天吸煙數(shù)量)方面沒(méi)有顯著差異(補(bǔ)充表1和2)。在兩組之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)α-和β-多樣性的差異；但是，幾個(gè)菌株在LN和HN組之間顯示了不同的豐度(圖1D)。在宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和宏基因組學(xué)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)B.xylansolvens可能含有尼古丁分解代謝基因，并被鑒定為與LN和HN組之間的分離相關(guān)的主要驅(qū)動(dòng)因素(圖1D)。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 1.高尼古丁和低尼古丁吸煙者的腸道菌群組成差異
研究者進(jìn)一步對(duì)B.xylansolvens進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加尼古丁對(duì)菌的生長(zhǎng)速度沒(méi)有影響；然而，B.xylansolvens有效地降解了添加到培養(yǎng)基中的尼古丁。為了檢測(cè)B.xylansolvens中尼古丁的降解代謝產(chǎn)物，進(jìn)行了B. xylanisolvens?的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并用層析法分離了尼古丁代謝物。用核磁共振對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了進(jìn)一步的表征，鑒定為4-羥基-1-(3-吡啶)-1-丁酮(HPB)，可在B.xylansolvens菌的培養(yǎng)基中檢測(cè)到。為了驗(yàn)證B.xylansolvens在體內(nèi)對(duì)尼古丁的降解特性，將該細(xì)菌定植到通過(guò)上述三種遞送策略給予尼古丁的SPF小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可以在體內(nèi)降解尼古丁，并伴隨著HPB的增加(圖1E)。
接下來(lái)，研究者對(duì)B.xylansolvens進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并研究了B.xylansolvens中尼古丁分解代謝的生物合成基因。在由這些測(cè)序基因編碼的潛在的尼古丁分解代謝蛋白中，nicX蛋白(由nicX基因編碼)具有類似于已知的尼古丁降解酶nicA的計(jì)算模型的預(yù)測(cè)核心結(jié)構(gòu)，nicX可在體外降解尼古丁。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證nicX的尼古丁降解能力，將NicX導(dǎo)入大腸桿菌或在B.xylansolvens中敲除。與野生型(WT)大腸桿菌相比，nicX-knockin大腸桿菌在體內(nèi)外獲得了降解尼古丁和產(chǎn)生HPB的能力(圖1F和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2J)。此外，B.xylansolvens中的nicX缺乏導(dǎo)致其尼古丁降解能力的喪失(圖1G和補(bǔ)充圖2K)。WT和nicX基因敲除的B.xylansolvens的生長(zhǎng)曲線沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著變化(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2L)。綜上所述，結(jié)果表明尼古丁在不同的給藥途徑中在腸道中積累，B.xylansolvens在nicX存在的情況下具有降解尼古丁的能力。
圖 1.鑒定腸道尼古丁積累和腸道細(xì)菌介導(dǎo)的的腸道尼古丁降解。
2.尼古丁降解延緩NAFLD進(jìn)展
通過(guò)飲用水口服尼古丁是研究尼古丁相關(guān)慢性代謝性疾病的一個(gè)廣泛使用的模型。為了確定腸道尼古丁積累的作用以及B. xylanisolvens對(duì)其降解在NAFLD進(jìn)展中的影響，用PBS(對(duì)照組)、B. xylanisolvens、尼古丁水、B. xylanisolvens加尼古丁水或nicX基因敲除B.xylansolvens加尼古丁水處理SPF鼠20周。WT和nicX基因敲除B. xylanisolvens成功地在HFHCD（高果糖高膽固醇飲食）喂養(yǎng)的SPF小鼠中定植(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3A)。然而，尼古丁的降解只在被B. xylanisolvens定植的組中觀察到(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3B)。各組之間沒(méi)有觀察到明顯的體重的變化(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3C，d)。
肝腫塊、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平與對(duì)照組相比，尼古丁處理組小鼠的肝臟質(zhì)量、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平以及肝臟甘油三酯水平都較高(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3E-I)。兩組間血清甘油三酯、肝臟和血清膽固醇酯及血清非酯化脂肪酸水平無(wú)顯著差異(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3j-m)。根據(jù)蘇木精伊紅(H&E)、油紅O和天狼星紅染色，在HFHCD喂養(yǎng)條件下，水中補(bǔ)充尼古丁加速了NAFLD的進(jìn)展，這種加速伴隨著更嚴(yán)重的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化(圖1H和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3n-r)。此外，涉及肝臟脂肪代謝、促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生和膠原合成的mRNAs的相對(duì)表達(dá)在添加尼古丁的水處理中被誘導(dǎo)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3s-u)，而這些Nash指標(biāo)通過(guò)WT?B.xylansolvens的定植而得到改善，但與nicX缺乏的b.xylansolvens無(wú)關(guān)(圖1H和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c-u)。
這些數(shù)據(jù)表明，尼古丁降解菌的定植可以減少尼古丁誘導(dǎo)的NASH，并且這種作用依賴于nicX的表達(dá)。
3.尼古丁激活腸道AMPKα-1
與之前的研究一致，研究者發(fā)現(xiàn)尼古丁處理以劑量依賴的方式誘導(dǎo)回腸器官中AMPKα在Thr172磷酸化(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4A，b)。此外，吸煙在回腸末端激活了回腸AMPKα，這種作用的強(qiáng)度與吸煙者組織中的尼古丁水平呈正相關(guān)(圖2A)。此外，在所有三種尼古丁暴露的SPF小鼠模型中，回腸中的磷酸化AMPKα(p-AMPKα)均增加(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4C-e)。AMPKα有兩種亞型，即AMPKα1和AMPKα2)。研究者建立了腸上皮特異性AMPKα1(Prkaa1ΔIE)和AMPKα2(Prkaa2ΔIE)基因敲除小鼠系(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4F)。
在沒(méi)有腸道AMPKα1的情況下，尼古丁完全失去了激活A(yù)MPKα1的能力，而在沒(méi)有腸道AMPKα2的情況下，尼古丁誘導(dǎo)的p-AMPKα的增加仍然發(fā)生，這表明AMPKα1是尼古丁在腸道中的主要靶點(diǎn)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4F)。B.xylansolvens的定植抑制尼古丁誘導(dǎo)的AMPKα在回腸的磷酸化(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4G)。與B.xylansolvens相似，nicX-knockin大腸桿菌在體內(nèi)能夠抑制尼古丁誘導(dǎo)的回腸AMPKα的磷酸化(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4H)。然而，在沒(méi)有nicX的情況下，沒(méi)有觀察到B.xylansolvens介導(dǎo)的抑制作用(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4I)。因此，B.xylansolvens在nicX存在下減輕了尼古丁誘導(dǎo)的回腸p-AMPKα的激活，這得到尼古丁分解代謝物HPB不能激活回腸p-AMPKα的支持(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4J)。
關(guān)于腸道AMPKα1在尼古丁加速的非酒精性脂肪肝進(jìn)展中的作用，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腸道上皮AMPKα1的缺失有助于改善尼古丁加速的NASH小鼠模型的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化(圖2B-f和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a-m)。
圖 2.尼古丁誘導(dǎo)的 NAFLD 進(jìn)展中腸 AMPKα-SMPD3 軸的激活
4.P-AMPKα使SMPD3在Ser208/20處磷酸化
脂質(zhì)被認(rèn)為在 NAFLD 進(jìn)展中具有重要作用，因?yàn)樗鼈兪窃摬±韺W(xué)中腸道和肝臟之間串?dāng)_的關(guān)鍵介質(zhì)。研究者進(jìn)一步對(duì)回腸進(jìn)行了靶向脂質(zhì)組學(xué)分析，并確定神經(jīng)酰胺是導(dǎo)致Prkaa1基因敲除(KO)和對(duì)照(WT)腸上皮在尼古丁治療下基于聚集分化的主要代謝物(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5n，o)。在尼古丁飲用模型中沒(méi)有腸道 AMPKα1 的情況下，回腸神經(jīng)酰胺譜較低（圖 2g）?；谀峁哦★嬘媚Ｐ突啬c上皮的磷酸化蛋白質(zhì)組分析（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 5p），腸上皮AMPKα1的缺失顯著降低了SMPD3的Ser208位的磷酸化(圖2H和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5Q)。
在回腸器官中，尼古丁處理沒(méi)有改變SMPD3的mRNA水平。然而，用AMPK激酶活性抑制劑或表達(dá)激活域突變體都可以緩解尼古丁誘導(dǎo)的SMPD3蛋白水平的增加(圖2I)，這表明尼古丁對(duì)SMPD3的影響是翻譯后的。發(fā)現(xiàn)在尼古丁處理下，SMPD3與AMPKα1結(jié)合(圖2J)。使用蛋白質(zhì)翻譯后修飾磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具GPS 2.0分析預(yù)測(cè)Ser208(小鼠)是AMPK最有可能的磷酸化位點(diǎn)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6C)。SMPD3中包括Ser208(人類中的Ser209)在內(nèi)的多肽滿足AMPK的磷酸化底物基序，并且在進(jìn)化上高度保守(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6D)。據(jù)報(bào)道，SMPD3的穩(wěn)定性受5個(gè)保守的絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化調(diào)節(jié)。在尼古丁治療組檢測(cè)到Ser209磷酸化增加(圖2K和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6E)。SMPD3(WT)可被AMPKα1直接磷酸化，當(dāng)Ser209突變或給予AMPK抑制劑時(shí)，這種磷酸化幾乎消失了(圖2L)。
為確定SMPD3在Ser209位的磷酸化是否影響SMPD3蛋白的穩(wěn)定性，將WT、S209A(缺失磷酸化突變體)和S209D(持續(xù)磷酸化突變體)SMPD3分別導(dǎo)入SW480細(xì)胞，并用尼古丁和放線菌酮(CHX)處理。發(fā)現(xiàn)Ser209的磷酸化保護(hù)SMPD3蛋白不被降解(圖3A)。在尼古丁飲用模型中分離的有機(jī)化合物中，觀察到缺乏腸上皮AMPKα1的小鼠的有機(jī)化合物中SMPD3的降解速度更快(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6F)。
此外，在尼古丁處理的SW480細(xì)胞中，SMPD3在Lys103處的去泛素化程度顯著高于DMSO處理的細(xì)胞(圖3B和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6G)。通過(guò)免疫沉淀，我們發(fā)現(xiàn)泛素化的SMPD3(Lys103)主要包含經(jīng)典的Lys48-連接Ub鏈(Lys48-Ub)，而不是Lys63-Ub，后者被尼古丁處理減少(圖3C，d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6h)。S209A突變逆轉(zhuǎn)了尼古丁誘導(dǎo)的SMPD3 Lys48-Ub的減少，K103R突變進(jìn)一步緩解了這一下降(圖3e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6i)。此外，開發(fā)了抗p-SPMD3(S209)和抗Ub-SMPD3(Lys103)抗體(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6J，k)，并證實(shí)尼古丁誘導(dǎo)的總SMPD3蛋白的增加是由于SMPD3磷酸化水平升高，隨后泛素化減少(圖3F)。
這些發(fā)現(xiàn)表明，尼古丁激活的AMPKα在Ser209位磷酸化SMPD3，這反過(guò)來(lái)又抑制SMPD3上Lys103的泛素化和隨后的Lys48-Ub降解途徑，從而提高SMPD3蛋白的穩(wěn)定性及其蛋白水平(圖3G)。進(jìn)一步檢測(cè)到尼古丁誘導(dǎo)的SMPD3在Ser208位的磷酸化，同時(shí)在Lys103位的SMPD3泛素化減少，這可以通過(guò)在NicX存在下B.xylansolvens的定植來(lái)緩解(圖3H)。吸煙者回腸的磷酸化和總SMPD3蛋白水平也高于非吸煙者，這與回腸尼古丁含量有關(guān)；而泛素化的SMPD3蛋白水平在非吸煙者、LN和HN組依次降低(圖3I)。
圖3.由于泛素化介導(dǎo)的降解減少，磷酸化的SMPD3更穩(wěn)定
5.P-AMPKα-SMPD_3-神經(jīng)酰胺軸與NASH
SMPD3被認(rèn)為是代謝性疾病的病理加速器。將SMPD3抑制劑GW4869應(yīng)用于有機(jī)化合物以抑制SMPD3活性。GW4869降低了尼古丁處理下類器官及其上清液中的神經(jīng)酰胺水平。慢病毒表達(dá)的SMPD3被用于從尼古丁飲用模型恢復(fù)Prkaa1基因敲除的回腸器官中SMPD3的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，SMPD3的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了由于回腸器官中AMPKα1缺乏而導(dǎo)致的神經(jīng)酰胺水平的降低。在尼古丁加速的NASH小鼠模型中，在B. xylanisolvens存在的情況下，被B.xylansolvens定植的SPF小鼠回腸神經(jīng)酰胺減少，這是由于腸道p-AMPKα-SMPD3軸被抑制所致。
在尼古丁加速的NASH小鼠模型中，為了證實(shí)神經(jīng)酰胺譜的調(diào)節(jié)是否與腸上皮細(xì)胞AMPKα1缺乏所致的NASH改善有關(guān)，研究者通過(guò)每日腹腔注射神經(jīng)酰胺(D18：1/16：0)。神經(jīng)酰胺給藥可逆轉(zhuǎn)AMPKα1對(duì)腸上皮遺傳破壞引起的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化的保護(hù)作用。此外，口服GW4869降低了回腸神經(jīng)酰胺的水平，并且在尼古丁飲用模型中伴隨著較低的NAFLD嚴(yán)重程度。
總之，尼古丁誘導(dǎo)的腸道AMPKα-SMPD3軸的激活通過(guò)增加腸道神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)非酒精性脂肪肝的進(jìn)展，因此抑制SMPD3是一種潛在的緩解肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化的策略。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 7.?p-AMPKα和SMPD3在腸道神經(jīng)酰胺產(chǎn)生中的相互作用
6.B. xylanisolvens與臨床非酒精性脂肪肝
為了闡明我們的發(fā)現(xiàn)與人類NAFLD進(jìn)展之間的相關(guān)性，我們收集了83名經(jīng)活檢證實(shí)的NAFLD患者的數(shù)據(jù)，這些患者被分為吸煙者(n=41)和非吸煙者(n=42)。在吸煙者中，NAFL、Borderline NASH和Defined NASH在煙草吸煙史(包括吸煙年限和每天吸煙數(shù)量)方面沒(méi)有顯著差異。然而，我們發(fā)現(xiàn)B.xylansolvens水平與NAFLD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，隨著NAFLD的進(jìn)展，糞便中尼古丁水平逐漸增加，糞便中尼古丁降解產(chǎn)物HPB相應(yīng)地隨著NAFLD的進(jìn)展而減少(圖4C，d)。在吸煙者中，B.xylansolvens豐度與糞便尼古丁含量呈負(fù)相關(guān)，但與HPB水平呈正相關(guān)(圖4e，f)。
在代謝指標(biāo)方面，糞便中B.xylansolvens和HPB的存在與血清ALT和AST水平呈負(fù)相關(guān)，而尼古丁濃度呈正相關(guān)(圖4G)。這些結(jié)果表明，B.xylansolvens介導(dǎo)的尼古丁降解可能保護(hù)吸煙者的肝功能。NASH患者的血清神經(jīng)酰胺水平，尤其是主要來(lái)自腸道的神經(jīng)酰胺(D18：1/16：0)水平顯著高于NAFL患者(圖4H)，并與B.xylansolvens的豐度呈負(fù)相關(guān)(圖4I)。
然而，在非吸煙者中，沒(méi)有觀察到B.xylansolvens的豐度與NAFLD嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了腸道尼古丁蓄積是吸煙者臨床NAFLD進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，同時(shí)也表明具有尼古丁降解活性的B.xylansolvens具有保護(hù)作用。
圖 4. B. xylanisolvens介導(dǎo)的尼古丁降解與臨床 NAFLD 進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。
總結(jié)
該研究發(fā)現(xiàn)尼古丁在吸煙期間在腸道中積聚并加速NAFLD的進(jìn)展，但它可以被人類共生菌B. xylanisolvens 有效降解。揭示了了腸道尼古丁積累的病理影響，并確定了一種內(nèi)源性尼古丁降解腸道細(xì)菌，該細(xì)菌對(duì)預(yù)防和治療吸煙者的 NASH 具有潛在價(jià)值。
姜長(zhǎng)濤教授、Frank Gonzalez研究員、虞朝輝教授、李洋研究員、鄭明華教授為本文的共同通訊作者。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士后陳博、美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院博士后孫露露、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士研究生曾廣易、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院沈哲教授、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士后汪鍇、復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院博士研究生尹利敏為本文的共同第一作者。百邁客生物可提供Illumina二代宏基因組、ONT三代宏基因組、PacBio全長(zhǎng)微生物多樣性、二代微生物多樣性、微生物絕對(duì)定量等全套測(cè)序分析服務(wù)，如果您對(duì)我們的服務(wù)感興趣，歡迎點(diǎn)擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費(fèi)為您設(shè)計(jì)文章思路方案。
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