干旱脅迫下玫瑰根和葉的生理特性變化及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組

文章題目：干旱脅迫下玫瑰根和葉的生理特性變化及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組

發(fā)表期刊：Plant and Cell Physiology

發(fā)表時(shí)間：2020年10月

影響因子：4.799

研究背景

干旱或缺水引起的脫水是世界上許多地區(qū)植物面臨的一種嚴(yán)重的非生物脅迫，嚴(yán)重制約著植物的生產(chǎn)力和生存。許多生物化學(xué)、生理和遺傳性狀已在不同的植物組織中進(jìn)化出來，特別是根和葉，以應(yīng)對(duì)干旱脅迫。根是感知水分缺乏最敏感的器官，并相應(yīng)的調(diào)節(jié)水分和養(yǎng)分的吸收。在有限的水分條件下，它們可以通過表型和結(jié)構(gòu)上的改變來增加枝條和葉片對(duì)水分的吸收，以維持正常的水分利用。葉片是光合作用和蒸騰作用的主要器官，調(diào)節(jié)水分的吸收和流失。葉片對(duì)干旱的反應(yīng)是萎蔫、氣孔關(guān)閉、角質(zhì)層蠟沉積和減少光合作用，以減少水分的過度流失。因此，根系和葉片是調(diào)節(jié)水分在土壤和水分之間流動(dòng)的最重要器官，但其對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制尚不清楚。

玫瑰是園藝作物之一，無論是盆栽植物和切花在招待、娛樂和保健行業(yè)都有相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于玫瑰生長(zhǎng)在亞熱帶氣候，對(duì)干旱和水分虧缺非常敏感，嚴(yán)重限制了其生長(zhǎng)和開花。此前對(duì)玫瑰花瓣的轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)確定了對(duì)疾病響應(yīng)、鹽度和熱脅迫以及與花色相關(guān)的基因。然而，玫瑰植株對(duì)干旱脅迫的分子響應(yīng)仍有待進(jìn)一步研究。

高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)已經(jīng)在楊樹和玉米中鑒定了許多干旱響應(yīng)基因。然而，傳統(tǒng)的RNA-seq產(chǎn)生的短讀序列并不包含完整的轉(zhuǎn)錄本，因此在預(yù)測(cè)新基因方面準(zhǔn)確性較低。PacBio和Oxford Nanopore Technology (ONT)是一種新穎的RNA-seq方法，可以通過高通量產(chǎn)生長(zhǎng)讀來讀取全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，從而重構(gòu)編碼基因組。此外，ONT可以直接對(duì)RNA進(jìn)行測(cè)序，并識(shí)別堿基修飾、可變剪接、聚腺苷酸化、和融合基因。因此，ONT RNA-seq在探索糧食作物和園藝作物抗旱性的分子機(jī)制方面很有前景。

在這項(xiàng)研究中，通過對(duì)正常、輕度和重度干旱條件下生長(zhǎng)的玫瑰幼苗的光合速率和植物激素水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并采用ONT法對(duì)其全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測(cè)序。通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，既豐富了已注釋的玫瑰基因組，又為激素在干旱脅迫中的潛在作用提供了新的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也識(shí)別出了在應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)激活的新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這項(xiàng)研究提供的數(shù)據(jù)可以為開發(fā)新的轉(zhuǎn)基因耐旱玫瑰品種鋪平道路。

材料和方法

樣品做了三組處理：干旱處理0天（ND stress）、5天（MD stress）和10天（SD stress），并對(duì)光合作用進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)了脫落酸（ABA）和生長(zhǎng)素（auxin）的含量。

結(jié)果分析

1.干旱脅迫對(duì)玫瑰幼苗生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)的影響

以2月齡玫瑰幼苗為材料，在不干旱(ND)、輕度干旱(MD)和SD脅迫條件下，對(duì)其相對(duì)含水量(RWC)和光合特性進(jìn)行了分析。與ND對(duì)照相比，MD和SD植株的RWC分別下降到41%和15%(圖1A)。此外，定期澆水的植株看起來健康，葉子呈綠色/深綠色，而暴露在MD脅迫下的幼苗變黃，一些葉子彎曲并枯萎(圖1A)。另一方面，SD條件導(dǎo)致葉片大面積枯萎和卷曲(圖1A)。與此相一致的是，SD脅迫下幼苗的鮮重和干重均顯著低于ND和MD組(圖1B)，說明過度脫水會(huì)降低養(yǎng)分吸收和植物生長(zhǎng)。

2.全長(zhǎng)RNA-Seq及功能注釋

為了闡明干旱響應(yīng)的分子機(jī)制，對(duì)不同處理植株的葉(L)和根(R)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。6個(gè)樣本(每個(gè)樣本3個(gè)生物重復(fù))共18個(gè)cDNA文庫，包括ND-L、MD-L、SD-L、ND-R、MD-R和SD-R。從最初的116,192,367 raw reads中，提取了115,374,531 (99.29%) clean reads，組成玫瑰全長(zhǎng)非嵌合轉(zhuǎn)錄組。通過與Rosa chinensis 基因組比對(duì)，在轉(zhuǎn)錄組中鑒定出了48,549個(gè)基因，占基因組長(zhǎng)度的21.46%。此外，共鑒定出59,404個(gè)開放閱讀框(ORF)，如圖2A所示，只有19個(gè)編碼序列(CDSs)編碼>800個(gè)氨基酸的多肽，而58%的CDSs編碼長(zhǎng)度在100 – 400個(gè)氨基酸的小肽(圖2A)。最后，89,044個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本中的58,753個(gè)可以被注釋到不同的數(shù)據(jù)庫中(圖2B)。

3.DEGs的比較分析

為了進(jìn)一步闡明干旱誘導(dǎo)的玫瑰葉片和根的轉(zhuǎn)錄組變異，相對(duì)于ND，篩選出了MD和SD樣品的DEGs。從18個(gè)cDNA文庫中檢測(cè)到48,549個(gè)基因的表達(dá)量，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR) (≤0.01)和log2值(≥2或≤0.05)鑒定出7,101個(gè)DEGs，其中669個(gè)(~9.4%)為新基因。此外，這些DEGs大部分在同一組的葉片和根中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。MD和SD組葉片分別鑒定出580和3,326個(gè)DEGs，而與其對(duì)應(yīng)的根部樣品分別鑒定出3,445和1,751個(gè)DEGs，這表明干旱響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制在根中占主導(dǎo)地位（圖 2C）。此外，在MD葉片和根中分別有237個(gè)和1438個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，343個(gè)和2007個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。意料之中的是，SD條件下導(dǎo)致了總體上更大的轉(zhuǎn)錄組變化，在葉片中有1284個(gè)上調(diào)基因和2042個(gè)下調(diào)基因，在根中有365個(gè)上調(diào)基因和1386個(gè)下調(diào)基因（圖2D）。與SD-L、MD-R和SD-R相比，在MD-L中分別鑒定出331、258和547個(gè)特異基因，與SD-L相比，MD-R中有2963個(gè)特異基因。此外，有855個(gè)基因在MD-R和SD-R中均存在，而所有組中共有的基因只有13個(gè)(圖2C)。編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、早期光誘導(dǎo)蛋白、線粒體磷酸載體蛋白、鋅指蛋白和谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶的DEGs主要集中在SD組，而細(xì)胞分裂控制蛋白在MD條件下誘導(dǎo)發(fā)生。

4.GO和KEGG富集分析DEGs

通過GO富集分析，將玫瑰葉片和根系干旱誘導(dǎo)基因分為生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)注釋。在MD-L中特異的干旱應(yīng)答基因富集在生物過程（天冬酰胺生物合成過程、鈣離子跨膜運(yùn)輸）、分子功能（天冬酰胺合成酶(谷氨酰胺水解)活性、β-amyrin合成酶活性）以及細(xì)胞成分（ COPII囊泡外殼）中。這些GO基因也在SD-L、MD-R和SD-R組中富集，表明這些基因可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或其他響應(yīng)干旱脅迫的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后的KEGG富集分析顯示，在MD脅迫下的玫瑰幼苗葉片在碳代謝(ko01200)、核糖體(ko03010)和aa的生物合成(ko01230)等方面的DEGs與其他樣品有顯著差異。受SD脅迫影響的基因主要涉及淀粉和蔗糖代謝(ko00500)、植物激素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)、核糖體(ko03010)、光合作用(ko00195)、碳代謝(ko01200)等。玫瑰幼苗根系中MD的響應(yīng)基因影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的碳代謝和蛋白質(zhì)加工。受MD和SD影響顯著的基因在苯丙素合成、植物激素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工等方面具有重要作用。綜上所述，調(diào)控碳代謝、植物激素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因受到干旱脅迫的影響，可能在葉片和根的適應(yīng)反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

5.干旱脅迫降低了玫瑰的光合性能

鑒于玫瑰葉片在干旱脅迫下顯著枯萎(圖1A)，因此對(duì)ND、MD和SD生長(zhǎng)條件下葉片的光合參數(shù)進(jìn)行了研究。雖然所有組的總?cè)~綠素含量沒有顯著差異(圖3 D)，但干旱脅迫顯著降低了Pn、Gs和Tr指數(shù)，在SD脅迫下降低的幅度比 MD更嚴(yán)重(圖3 B、C、F)。葉片中的Ci水平對(duì)MD和SD脅迫有不同的相應(yīng)。MD處理下的平均Ci降低了111 μmol/mol，長(zhǎng)期干旱后Ci值增加了62.33μmol/mol，恢復(fù)正常。由此可見，干旱脅迫不利于玫瑰植株的光合性能，限制了葉片的生長(zhǎng)。MD條件下的水分利用效率(WUE)高于ND和SD(圖3E)，說明輕度水分虧缺增加了葉片有效利用水分的能力。為了進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制，對(duì)與光合作用途徑相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。干旱脅迫下與光合作用相關(guān)的DEGs包含編碼PS II、PS I、葉綠體三磷酸腺苷(ATP)合酶亞基(ATP合酶)和葉綠素a/b結(jié)合蛋白。如圖3G所示，幾個(gè)PSII(gene 14042,gene 26289等)、PS I (gene 29343,gene 10875等)和ATP合酶(gene 28095, gene 31836等)基因在SD脅迫下表達(dá)下調(diào)至少0.5倍(圖3 G)。綜上所述，干旱脅迫誘導(dǎo)了玫瑰葉片的光合動(dòng)態(tài)在轉(zhuǎn)錄水平上的變化。

6.干旱脅迫使脫落酸和生長(zhǎng)素濃度增加

KEGG分析顯示，干旱脅迫下植物激素和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ko04075)顯著富集。ABA和生長(zhǎng)素是干旱脅迫下調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要激素，因此對(duì)干旱脅迫下玫瑰葉片和根中的這兩種激素的水平進(jìn)行了檢測(cè)。ABA含量在干旱條件下急劇增加，并在長(zhǎng)期(SD)脅迫下達(dá)到峰值(圖4A)。與對(duì)照相比，MD和SD環(huán)境下葉片中吲哚-3-甲醛（ICA）的含量分別上升3.44和7.96 ng/g，根中分別上升1.15和4.02 ng/g（圖4 E）。長(zhǎng)期干旱脅迫下葉片中吲哚乙酸（IAA）含量顯著下降，根系中IAA含量在MD中增加，而在SD中下降(圖4 G)。相比之下，干旱脅迫下的玫瑰幼苗葉片和根中ME-IAA含量均顯著增加，且與SD相比，MD脅迫下葉片中ME-IAA含量更高(圖4 F)。最后，在干旱脅迫下，葉片中的IP濃度顯著降低，而根系中的IP濃度顯著升高(圖4 G)。在任何條件下都不能檢測(cè)到IBA水平。綜上所述，干旱脅迫觸發(fā)了玫瑰葉片和根部的激素變化，以維持生理過程。

7.DEGs參與ABA和生長(zhǎng)素的生物合成及信號(hào)通路

與上述結(jié)果一致的是，干旱響應(yīng)的DEGs在類胡蘿卜素生物合成(次生代謝產(chǎn)物)、ABA生物合成和ABA信號(hào)通路中顯著富集。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中監(jiān)測(cè)到的ABA和生長(zhǎng)素合成以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)模式(圖4B, D)，4個(gè)NCEDs，ABA合成的步驟，在MD-L和MD-R中誘導(dǎo)上調(diào)。轉(zhuǎn)錄本(gene 4639)編碼PYR/PYL，是ABA信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，在所有組中表達(dá)上調(diào)。9個(gè)ABA誘導(dǎo)的PP2Cs，包括4個(gè)抑制ABA信號(hào)、促進(jìn)GA信號(hào)的HAI同源物和5個(gè)激活A(yù)BA和Snf1相關(guān)激酶OST1的HAB同源物在MD和SD脅迫下均顯著上調(diào)。另外，SnRK2基因有2個(gè)在MD-L中上調(diào)(gene 10030, 2.45倍，gene 49803, 2.17倍)，有3個(gè)在MD-R中上調(diào)(gene 10030, 4.81倍，gene 49802, 2.48倍，gene 49803, 2.91倍)，有2個(gè)SnRK2基因在MD-L中下調(diào)(gene 49801, 0.17倍，gene 49802, 0.49倍)。最后，有3個(gè)ABF轉(zhuǎn)錄因子(gene 37633, gene 42692, gene 47967)在SD-L和SD-R 中上調(diào)，進(jìn)而激活A(yù)BA響應(yīng)基因。

絲蘭黃素單加氧酶是生長(zhǎng)素合成的核心酶，在MD-L、SD-L、MD-R和SD-R樣品中均有高度誘導(dǎo)。TAA1控制陰暗條件下生長(zhǎng)素的產(chǎn)生，并且在任何轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)都沒有差異。在生長(zhǎng)素響應(yīng)基因中，有6個(gè)SAUR基因在MD-L和SD-L下顯著上調(diào)，2個(gè)基因下調(diào)(圖4D)。一個(gè)生長(zhǎng)素受體F-box 蛋白TIR1(gene 49288)在SD-L中誘導(dǎo)上調(diào)3.22倍，2個(gè)AUX基因（gene 18102和gene 55695）在MD-L中誘導(dǎo)上調(diào)2倍。2個(gè)與生長(zhǎng)素信號(hào)傳遞相關(guān)的IAA-酰基酸-酰胺合成酶（gene 37308, gene 41087）也在干旱脅迫下被誘導(dǎo)。18個(gè)調(diào)控生長(zhǎng)素反應(yīng)的基因ARF差異表達(dá):6個(gè)在SD-L和MD-R中上調(diào)，7個(gè)在MD-L和SD-L中下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)與干旱引起的生長(zhǎng)素含量變化在前一節(jié)中的描述一致。

8.TFs 和IncRNA的鑒定

干旱脅迫顯著改變了玫瑰葉片和根中與DEGs相關(guān)的279個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。MD和SD條件下，MYB、bHLH、b-ZIP、NF-Y、WRKY和AP2家族的TFs顯著富集，其中MYB、AP2和WRKY占主導(dǎo)，差異表達(dá)的TFs分別為124、46和27個(gè)(圖5A)。bHLH和WRKY家族對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)非常相似。在MD-L處理中，有少量的DEGs、上調(diào)基因，但有大量的下調(diào)基因。相比之下，SD-L處理在這些基因家族中導(dǎo)致了更多的上調(diào)基因，并且適應(yīng)干旱后的葉片和根的干旱響應(yīng)的倍數(shù)變化通常低于SD處理。如圖5C所示，在干旱脅迫下，葉片和根中分別有133和177個(gè)TF基因差異表達(dá)(圖5 C)，其中31個(gè)基因是兩個(gè)器官共有的且表達(dá)模式相似。例如，gene 6966和49627在MD和SD條件下，在葉片和根中都是表達(dá)上調(diào)。一些蛋白激酶家族，包括RLK/Pelle_DLSV(142個(gè)成員，玫瑰轉(zhuǎn)錄組中較大的家族)和RLK/Pelle_ RLCK -VIIa -2(101個(gè)成員)(圖5 B)，在玫瑰轉(zhuǎn)錄組中負(fù)責(zé)蛋白激酶的大小。

lncRNAs是非編碼轉(zhuǎn)錄本，可調(diào)節(jié)順式和反式基因的轉(zhuǎn)錄，從而控制組織發(fā)育的各個(gè)方面和對(duì)外部刺激的反應(yīng)(Kim和Sung 2012)。我們利用Pfam、編碼潛力計(jì)算器(CPC)、編碼潛力評(píng)估工具(CPAT)和編碼非編碼索引(CNCI)數(shù)據(jù)庫篩選了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別鑒定出184、5,803、3,247和3,100個(gè)注釋轉(zhuǎn)錄本(圖5 F)，其中2,410個(gè)新的lncRNAs注釋到了所有數(shù)據(jù)庫（圖5 E）。此外，這些常見lncRNAs中，65.64%(1582)為lincRNAs，4.61%(111)為反義lncRNAs，1.74%(42)為內(nèi)含子lncRNAs，28%(675)為正義lncRNAs(圖5 E)。我們還預(yù)測(cè)了2,403個(gè)lncRNAs的20,240個(gè)靶基因，其中537個(gè)和19,703個(gè)靶基因分別受反式和順式lncRNA的調(diào)控。因此，這些lncRNAs可能在應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)通過調(diào)控關(guān)鍵基因發(fā)揮重要作用。

9.干旱脅迫下玫瑰葉和根中DEGs聚類

接下來，根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定了7101個(gè)DEGs，占本研究鑒定的所有基因的14.63% (7,101/48,549)。這些DEGs的熱圖表現(xiàn)出兩個(gè)保守組，如在干旱脅迫下誘導(dǎo)和抑制根和葉的表達(dá)模式(圖6 A)。然后使用K-means算法進(jìn)行富集分析，得到16個(gè)聚類(K1-K16)(圖6 B)。在SD條件下，K12、K13和K16基因主要在葉片和根中表達(dá)，表明它們可能參與干旱脅迫。而在MD和SD處理下，K4、K5、K7、K9和K11基因在根和葉中均受到抑制。

我們還通過加權(quán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析來確定與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因簇或模塊。所有基因聚類為33個(gè)模塊(圖6 C、E)，其中tomato modules與SD-R、fire-brick與SD-L、light steel blue與MD-L、medium purple與ND-L和ND-R顯著相關(guān)(圖6 D)。各模塊KEGG富集分析顯示，干旱脅迫下大部分樣品富集苯丙素生物合成(ko00940)和核糖體(ko03010)，SD-R樣品富集最顯著的通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(ko04141)(圖6 F)。綜上所述，上述途徑調(diào)節(jié)了玫瑰葉片和根系對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

10.可變剪接異構(gòu)體及可變剪接的變化

RNA-Seq檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本與R.chinensis ‘Old Blush’基因組進(jìn)行比對(duì)，鑒定剪接異構(gòu)體。如圖7 A所示，我們從非冗余轉(zhuǎn)錄本中檢測(cè)到42,544個(gè)可變剪接(As)，包括12,096個(gè)內(nèi)含子保留(IRs)、12,914個(gè)選擇性3’剪接位點(diǎn)(alt 3’)、7,433個(gè)選擇性5’剪接位點(diǎn)(alt 5’)、9,406個(gè)外顯子跳過(ES)和695個(gè)互斥外顯子(ME)(圖7 A)。IR在玫瑰葉片中最為常見，在ND-L、MD-L、SD-L和ND-R樣品中的比例分別占34.77%、30.83%、30.1%和29.56%。而在SD脅迫下，ES是主要的AS模式(占所有AS事件的32.16%)。在MD-R中最常見的AS事件是alt 3’ (32.38%)， ME(1.75%)是最罕見的（圖7 B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄組剪接異構(gòu)體，我們隨機(jī)選擇了三個(gè)至少注釋到兩個(gè)異構(gòu)體上的基因(ONT.25325、gene 3669和gene 4728)進(jìn)行RT- PCR驗(yàn)證。在這些基因的第一個(gè)外顯子和最后一個(gè)外顯子或適當(dāng)區(qū)域設(shè)計(jì)引物。如圖7 C所示，片段的條帶大小與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的剪接亞型的條帶大小一致。對(duì)推測(cè)的剪接異構(gòu)體進(jìn)行克隆、測(cè)序和比對(duì)，以驗(yàn)證剪接連接。例如，ONT. 25325編碼了一個(gè)putative protein，呈現(xiàn)出4個(gè)剪接亞型(圖7C)，并隨后得到證實(shí)。此外，gene 3669和gene 4728顯示出相同的剪接變異。此外，一些剪接異構(gòu)體，如gene 3669，在對(duì)照和干旱脅迫下表現(xiàn)出差異。新的可變剪接體的鑒定進(jìn)一步注釋了R.chinensis ‘Old Blush’基因組。

總結(jié)

作者分析了干旱引起的玫瑰幼苗葉片和根部光合作用和激素水平的變化，首次在MD和SD條件下建立了全長(zhǎng)玫瑰轉(zhuǎn)錄組，并鑒定了組織特異性的干旱響應(yīng)基因、TFs 、lncRNA和AS。鑒定出特定組織在不同干旱條件下參與光合作用，ABA和生長(zhǎng)素生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)的基因模塊，本研究中提供的信息補(bǔ)充了R. chinensis的現(xiàn)有注釋，并為未來玫瑰植物抗旱性的機(jī)理和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：Wei Li, Lufeng Fu, Ziwen Geng, Xiaojuan Zhao, Qinghua Liu, Xinqiang Jiang, Physiological Characteristic Changes and Full-Length Transcriptome of Rose (Rosa chinensis) Roots and Leaves in Response to Drought Stress[J],?Plant and Cell Physiology, 2020.