Iso-RNA（ONT）實(shí)驗(yàn)流程材料方法

 

1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號：RN40））試劑盒

3)動物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號 ：Nanodrop2000）對于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號：LabChip GX Touch HT）對完整性進(jìn)行檢測

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時若GX檢測6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫方法

3.1建庫流程

1) 利用帶OligodT的反轉(zhuǎn)錄引物通過退火與mRNA的polyA尾結(jié)合，然后加入RT逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈

2)使用含barcode的擴(kuò)增引物擴(kuò)增成雙鏈cDNA，并為樣品加上barcode

3)使用NEB Next FFPE DNA Repair Mix和NEB Next Ultra II End Repair/dA-Tailing Module完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加A

4)使用SQK-LSK114試劑盒完成測序接頭的連接

3.2建庫設(shè)備

數(shù)字 3*32PCR 儀 廠家 Appliedbiosystems 儀器規(guī)格 proflex3*32

制冷型程控五段金屬浴 廠家 天根生化 儀器規(guī)格 OSE-DB-02

3.3建庫試劑盒

1)PCR條形碼試劑盒 貨號 EXP-PBC096 廠家 Nanopore

2)NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號 M6630L 廠家 NEB

3)NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號 E7546L 廠家 NEB

4)連接測序試劑盒 V14 貨號 SQK-LSK114 廠家 Nanopre

4、測序方法

4.1上機(jī)操作

1)用測序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix

2)用測序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫

3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開始測序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時

4.2測序設(shè)備

PromethION48 測序儀 廠家 Nanopore 儀器規(guī)格 PromethION48

4.3測序試劑

測序芯片制備試劑盒 廠家 Nanopore 貨號 EXP-FLP004

測序輔助擴(kuò)展試劑盒 廠家 Naonopore 貨號 EXP-AUX003

測序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 廠家 Nanopore 貨號 FLO-PRO114M